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目的检测内质网应激、自噬在绿脓杆菌制剂(PA-MSHA, Pseudomonas aeruginosa-mannose sensitive hemagglutinin)抗人乳腺癌细胞增殖、诱导凋亡过程中的作用,并深入探讨其机制,以更深入全面的了解PA-MSHA对人乳腺癌细胞的作用机制和耐药机制。方法第一部分1、透射电子显微镜观察PA-MSHA作用后细胞亚结构形态的变化。2、Western blot法检测PA-MSHA作用后内质网应激相关蛋白水平的变化。3、荧光显微镜观察PA-MSHA作用后乳腺癌细胞内绿色荧光斑点形态的变化情况。4、Western blot法检测PA-MSHA作用后自噬相关蛋白水平的变化。第二部分1、光学显微镜观察PA-MSHA、自噬抑制剂3-MA作用后乳腺癌细胞形态变化。2、Annexin V-FITC和PI染色流式细胞计数法、WST法、western blot检测3-MA对PA-MSHA诱导人乳腺癌细胞凋亡的影响。3、设计并合成针对人IRE1基因的shRNA片段,将shIRE1片段转入乳腺癌细胞中,Western blot法验证shRNA下调IRE1表达的有效性。4、观察IRE1下调后PA-MSHA对自噬水平以及细胞增殖水平的影响。主要采用Annexin V-FITC和PI染色流式细胞计数法、Hoechst33258染色、western blot等方法检测IRE1对于PA-MSHA引起的抗增殖、细胞凋亡等的影响。第三部分1、裸鼠乳房脂肪垫(mammary fat pad, MFP)接种人乳腺癌细胞,建立裸小鼠乳腺原位移植瘤模型。2、通过原位肿瘤大小、生长情况、TUNEL试验和western blot等探讨PA-MSHA及自噬抑制剂3-MA对裸鼠原位肿瘤生长的影响。结果第一部分1、乳腺癌细胞株MDA-MB-231HM细胞体外培养,经PA-MSHA处理后,乳腺癌细胞内部呈现出大量扩张的内质网腔,内质网应激的标志性分子GRP78/Bip和CHOP经western blot检测表达升高,且呈剂量和时间依赖性。2、乳腺癌细胞株MDA-MB-231HM细胞体外培养,经PA-MSHA处理后,乳腺癌细胞内部自噬泡数量增多；转染GFP-LC3的细胞胞浆内出现典型的绿色荧光斑点；自噬的标志性分子LC3和ATG5经western blot检测蛋白表达量升高,且呈剂量和时间依赖性。第二部分1、MD A-MB-23、MDA-MB-231HM和MDA-MB-468细胞分别经PA-MSHA,3-MA, PA-MSHA联合3-MA处理48小时后,光镜下观察到PA-MSHA联合3-MA处理组的细胞表现为皱缩、凋亡的细胞形态。Annexin V-FITC和PI染色流式细胞计数法、WST法、western blot检测均提示PA-MSHA联合3-MA处理组中细胞凋亡的比例高于单纯PA-MSHA或者3-MA处理组。2、shIRE1下调乳腺癌细胞IRE1基因后,MDA-MB-231、MDA-MB-231HM经PA-MSHA处理,采用Annexin V-FITC和PI染色流式细胞计数法、Hoechst33258染色、western blot等方法检测发现shIRE1组自噬水平下降,凋亡比例增加。第三部分PA-MSHA可以显著抑制小鼠移植瘤生长速度并缩小肿瘤体积大小,shIRE1具有提高PA-MSHA减缓移植瘤生长速度的作用。TUNEL试验、western blot也提示shIRE1联合PA-MSHA可以增加移植瘤中凋亡细胞的数量和凋亡相关蛋白的表达。结论PA-MSHA在抑制乳腺癌细胞的生长的同时,可以引起细胞的内质网应激和自噬。PA-MSHA能通过内质网应激中IRE1通路激活自噬。自噬降低PA-MSHA抑制乳腺癌细胞生长的能力,抑制自噬可以提高PA-MSHA的细胞毒性作用。