论文部分内容阅读
目的构建钙周期素结合蛋白（calcyclin binding protein, CacyBP）基因的亚细胞定位慢病毒载体并进行慢病毒的包装与滴度测定。方法以结肠癌HCT-116细胞株的cDNA序列为模板，根据CacyBP基因序列设计并合成引物，PCR扩增编码CacyBP的基因片段并回收纯化；采用Nco I/Xho I双酶切后定向克隆到亚细胞定位载体：pCMV/myc/nuc（胞核定位载体）和pCMV/myc/cyto（胞浆定位载体）；转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在氨苄青霉素阳性LB培养基平板上筛选出阳性克隆；重组质粒经PCR及双酶切鉴定并进行测序。以pCMV/myc/nuc-CacyBP，pCMV/myc/cyto-CacyBP， pCMV/myc/nuc-GFP为模板，选择适当的引物PCR后得到含EcoR I和Nhe I酶切位点的CacyBP-NLS，CacyBP基因片段；含Age I和EcoR I酶切位点的GFP-NLS基因片段；将其构建到慢病毒载体上得到重组质粒LV-GFP-hCacyBP-NLS，LV-GFP-hCacyBP，LV-GFP-NLS，酶切并测序鉴定正确后，将重组载体与慢病毒辅助包装载体pHelper1.0及pHelper2.0共转染293T细胞后包装出复制缺陷型慢病毒颗粒，而后qPCR法测定慢病毒滴度。结果1.从HCT-116的cDNA模板扩增684bp的CacyBP基因片段，分别构建重组质粒pCMV/myc/nuc-CacyBP、pCMV/myc/cyto-CacyBP，PCR及双酶切鉴定产物大小与预期值相符合，测序分析进一步表明所克隆的基因为编码CacyBP的基因片段。2.通过感染293T细胞，测得重组慢病毒LV-GFP-CacyBP-NLS，LV-GFP-CacyBP，LV-GFP-NLS滴度分别为2E+8TU/ml，2E+9TU/ml，2E+8TU/ml。结论1.成功构建CacyBP基因的亚细胞定位慢病毒载体。2.重组慢病毒载体和辅助质粒成功包装成高滴度的慢病毒颗粒。3.为后续将此慢病毒感染人结肠癌SW480细胞，研究其定位于胞核、胞浆中对细胞恶性表型的调节作用提供了一个平台。