滇重楼与七叶一枝花化学成分及生物活性的研究

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《中国药典》(2010版)收录的重楼(Paridis rhizoma)是百合科(Liliaceae)重楼属(Paris)植物——滇重楼(Paris polyphylla Smith var. yunnanensis (Franch.) Hand.-Mazz.)或七叶一枝花(Paris polyphylla Smith var. chinensis (Franch.) Hara)的干燥根茎。重楼属植物含有甾体皂苷、甾醇、甾醇苷、黄酮苷、氨基酸、脂肪酸、微量元素、多糖等多种化学成分;其中,甾体皂苷为其主要的活性成分,具有抗肿瘤、消炎、抑菌、镇静、止血等多种重要的生理活性,临床上广泛用于子宫出血、慢性支气管炎和流行性腮腺炎等症的治疗,以及各种癌症的防治。为了进一步阐明滇重楼与七叶一枝花在化学物质组成及生物活性方面的差异,本研究采用植物组织化学、药理学以及DNA指纹图谱和化学指纹图谱术,分别从化学成分、形态结构和生物活性方面,对滇重楼与七叶一枝花进行比较研究,并对不同产地重楼种质资源的DNA和化学指纹图谱特征进行了研究,旨在为合理开发和利用重楼资源提供一定的研究基础。论文的主要研究结果如下:1.采用GC-MS技术对滇重楼与七叶一枝花脂溶性成分的组成及含量进行了研究。实验结果表明,两种重楼脂溶性成分的组成较为一致,包含棕榈酸、硬脂酸等11种共有成分,但各组分相对含量存在差异。两种重楼饱和脂肪酸(SFA)含量较低,其相对含量分别为22.81%和30.13%;而不饱和脂肪酸(UFA)含量较高,分别为75.55%和66.64%。2.采用微波消解-火焰原子吸收光谱法对滇重楼与七叶一枝花中7种常见无机元素的含量进行了测定。实验结果表明,滇重楼中三种宏量元素的含量(Ca>K>Mg)高于七叶一枝花(K>Ca>Mg);七叶一枝花中除了Cu的含量略低于滇重楼外,其他三种微量元素的含量均高于滇重楼,二者微量元素含量均为Fe>Zn>Mn>Cu。3.采用Folin-Ceocalteu法对滇重楼与七叶一枝花的总多酚含量进行了测定。实验结果表明,滇重楼和七叶一枝花不同提取物的总多酚含量依次为:EAF(乙酸乙酯相提取物)>CME(甲醇粗提物)>WF(水相提取物)>BF(正丁醇相提取物);七叶一枝花不同提取物的总多酚含量高于滇重楼,其EAF的总多酚含量(22.15±0.08 mg/g)为所有提取物中最高。4.采用加热回流法、超声提取法和索氏提取法,对滇重楼与七叶一枝花的重楼皂苷进行制备,HPLC-ELSD法测定不同提取物的重楼皂苷含量。实验结果表明,三种提取方法均能有效制备重楼皂苷,且得率相当。加热回流法和索氏提取法可以互相替代,且优于超声提取法。HPLC-ELSD测定结果表明,由加热回流法制备所得滇重楼皂苷含量约为七叶一枝花的1.81倍。5.采用显微观察及组化定位方法,以七叶一枝花为研究对象,探讨其不同营养器官的形态结构特征及重楼皂苷的分布情况。实验结果表明,七叶一枝花各营养器官的形态结构与滇重楼较为类似,七叶一枝花根状茎的维管束为周木型,而滇重楼中也可见周韧型。重楼皂苷组化定位的研究结果表明,七叶一枝花不同营养器官中均有重楼皂苷的分布,其皂苷含量的高低顺序依次为:根状茎>茎>不定根>叶。6.采用DPPH自由基清除活性、β-胡萝卜素-亚油酸漂白体系、FeCl3/K3Fe(CN)6体系,以及O2-·清除活性等四种体外抗氧化评价体系,考察了滇重楼与七叶一枝花不同提取物的抗氧化活性。实验结果表明,两种重楼不同提取物在四种评价体系中均表现出一定的抗氧化活性,以七叶一枝花各提取物的抗氧化活性强于滇重楼。7.对于滇重楼和七叶一枝花不同提取物抑菌活性的研究结果表明,七叶一枝花EAF的抑菌活性强于滇重楼。滇重楼EAF对所试菌株作用强度的大小依次为:肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)>大肠杆菌(Escherichia coli),其对肺炎克雷伯氏菌的MIC值为50.00 mg/mL;七叶一枝花EAF对各敏感菌株作用强度的大小依次为:枯草芽孢杆菌(B. subtillis)>凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)>大肠杆菌(E. coli)>肺炎克雷伯氏菌,对凝结芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌的MIC值均为0.78 mg/mL,MBC值为50.00 mg/mL;而对于肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌的MIC值均为1.56 mg/mL,MBC值为50.00 mg/mL。8.滇重楼与七叶一枝花总皂苷对Caco-2细胞增殖抑制作用的研究结果表明,七叶一枝花总皂苷对Caco-2细胞生长的抑制作用较弱;而滇重楼总皂苷对Caco-2细胞的生长抑制作用明显,且呈现一定的浓度和时间依赖效应。从细胞形态结构观察、细胞周期分析、Caspase-3活性检测、线粒体膜电位测定等一系列实验结果推测,滇重楼总皂苷可能通过线粒体途径诱导Caco-2细胞发生凋亡。9.建立了重楼种质资源的AFLP指纹图谱。研究结果表明,8对引物组合从27份重楼种质资源中共扩增出1059条带,其中多态性条带1019条,所有种质的共有带为40条。相同引物组合分别从滇重楼种质、七叶一枝花种质和多叶重楼种质资源中扩增产生了63、60和31个特异位点。所建AFLP指纹图谱能够有效区分滇重楼、七叶一枝花和多叶重楼三个不同类群,且以七叶一枝花的多态百分率最高(90.80%),其次是滇重楼(89.01%),而多叶重楼最低(81.90%)。聚类分析结果表明,滇重楼、七叶一枝花以及多叶重楼种质资源之间的遗传相似度较高(0.51~0.79),亲缘关系较近,支持传统形态学分类的结果。10.建立了重楼种质资源的ISSR指纹图谱。研究结果表明,8条引物从27份重楼种质资源中共得到扩增位点71个,其中多态性位点70个,多态位点百分率为98.59%,表明所考察重楼种质资源具有较丰富的遗传多样性。分别从滇重楼种质资源中获得多态性位点58个,多态百分率为93.55%;从七叶一枝花种质资源中获得多态性位点60个,多态百分率为96.77%;从多叶重楼中获得多态性位点51个,多态百分率为96.23%,以七叶一枝花的多态百分率最高,滇重楼最低。聚类分析结果表明,多叶重楼种内的遗传变异水平(0.57)高于滇重楼(0.67)和七叶一枝花(0.61),而滇重楼与七叶一枝花种内的遗传变异程度较为相似。11.建立了陕西、湖南、四川和云南四个产地共44批重楼药材的HPLC指纹图谱。实验结果表明,44批重楼药材的相似系数在0.854-0.998之间;所有药材的皂苷含量均高于《中国药典》(2010版)规定的含量水平;陕西重楼药材的皂苷含量(4.66%)低于湖南(8.58%)、四川(11.90%)和云南(9.24%)的药材,四川重楼药材的皂苷含量最高;滇重楼皂苷含量(9.97%)高于七叶一枝花(5.40%)。本研究所建HPLC指纹图谱具有信息量大、可靠、快速等特点,能够较为全面地反映重楼药材的化学指纹特征,可以作为该药材质量控制和评价的有效方法。
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