胃癌人源异种移植模型的优化与评价

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目的:本研究通过建立胃癌人源肿瘤组织异种移植小鼠模型,分析影响模型建立成功的因素,探索小鼠模型体内肿瘤生长情况的判断方法,以优化模型建立的方法,从而提高PDX建模成功率。为胃癌的研究及胃癌患者精准治疗方案的筛选提供高效的临床前模型。方法:本研究纳入来自兰州大学第二医院肿瘤外科2019年10月至2022年1月,共33例胃癌患者。这些患者的肿瘤组织中6例取自胃镜活检术,25例取自腹腔镜胃癌根治术,2例取自胃镜活检术与腹腔镜手术。将这些患者的新鲜肿瘤组织(F0)以1×1×1~3×3×3mm~3大小在离体后24h内的不同时间移植到NOD/SCID小鼠的单侧或双侧肾包膜、腹股沟、腋下、肌肉,大网膜处建立胃癌PDX模型。同时(1)分析患者的临床特征,包括年龄、性别、Borrmann分型、ki67阳性细胞数、TNM分期、血生化水平、肿瘤标记物水平、凝血因子水平与模型成功构建的关系。(2)分析患者肿瘤组织的取材方式、移植部位、病理类型、分化程度、移植时间及移植物大小对模型建立的影响。(3)PDX模型建立后探索使用核磁共振成像(MRI)技术每隔7~10天观察PDX模型各移植部位肿瘤生长情况,并绘制肿瘤生长曲线,待肿瘤组织增大至300-500mm~3时取出(记为F1代)。(4)将一部分肿瘤组织用于传代(F2,F3)。另一部分做病理HE染色、免疫组织化学染色(Ki67),全外显子组测序比较PDX模型的肿瘤组织与患者原发肿瘤组织的一致性。剩余组织置于组织保存液中低温保存用于复苏。结果:本研究使用33例胃癌患者的肿瘤组织总共构建PDX模型82只,其中观测前因术后感染死亡9只,死亡率10.9%,观测的73只PDX模型中,成功建立28只,成功率为38.4%(28/73),平均肿瘤生长时间为38.6天。(1)建模成功组与失败组患者相比,ALB(P=0.007)和FⅦ(P=0.009)水平明显增高,NLR水平减低(P=0.022),淋巴细胞绝对计数(ALC)(P=0.023)水平在建模成功组也高于失败组。建模成功组与失败组患者相比,患者年龄、性别、Borrmann分型,ki67阳性细胞数,TNM分期,中性粒细胞绝对计数(ANC)、HGB、PLT,CEA、CA125、CA199、APTT、FIB、PT、D-dimer、FⅧ、FⅩ水平无明显差异(P>0.05)。(2)模型成功建立与取材方式有关(P=0.007),与移植部位有关(P=0.000),与肿瘤病理类型有关(P=0.033),与肿瘤分化程度有关(P=0.028),与肿瘤组织移植时间有关(P=0.003),与移植肿瘤大小有关(P=0.033)。手术取材的移植成功率48.1%(25/52)较活检14.3%(3/21)高(P<0.01);肾包膜的移植成功率28.3%(34/120)较腹股沟3.1%(2/66)、腋下0%(0/20)、大网膜0%(0/16)、肌肉0%(0/18)高(P<0.01);神经内分泌癌的移植成功率100%(3/3)较腺癌37.9%(25/66)高(P>0.05),较鳞癌0%(0/4)高(P<0.05);低分化肿瘤组织移植成功率为51.2%(21/41)较中高分化21.9%(7/32)高(P<0.05);2小时内移植成功率55.6%(20/36)较2小时后21.6%(8/37)高(P<0.01);肿瘤组织块大小为2×2×2mm~3时移植成功率为57.1%(16/28)较1×1×1mm~3时成功率27.6%(8/29)高,较3×3×3mm~3时成功率25%(4/16)高(P<0.05)。(3)对MRI观察中有肿瘤生长的PDX模型进行测量,发现建模成功的PDX模型肿瘤生长曲线表现为建模后的前25天肿瘤体积减小,25天之后肿瘤体积逐渐增大,而建模失败的PDX模型肿瘤生长曲线表现为建模后肿瘤体积持续减小,至32天肿瘤消失。(4)PDX模型移植瘤与患者肿瘤组织HE染色结果提示F1代PDX模型与患者肿瘤组织(F0)均为低分化胃腺癌,F2和F3代PDX模型为中高分化胃腺癌。免疫组织化学染色表明:Ki67阳性细胞数(%)在F0-F3代相似分别为21%,17%,23%,25%。全外显子组测序结果表明,患者肿瘤与PDX模型微卫星不稳定型均为高度不稳定型,错配修复基因致病性突变均未检出。在患者肿瘤中检测出PTEN基因c.C892T位点突变,FGFR1基因c.T665C位点突变,TP53基因为野生型,与PDX模型的检测结果保持一致。结论:(1)胃癌患者手术后取材的组织、低分化肿瘤组织,大小为2×2×2mm~3,在2h内移植于NOD/SCID小鼠的肾包膜下有更高的移植成功率。(2)胃癌PDX模型移植成功率可能与患者血清ALB,ALC,NLR,FVII水平和肿瘤组织病理类型有关。(3)核磁共振成像可作为无创连续评价胃癌PDX模型建立成功与否的手段。(4)胃癌PDX模型具有较好的保真性。
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