目的在建立二亚硝基哌嗪诱导气虚体质状态大鼠鼻咽黏膜上皮细胞癌变模型基础上,应用益气解毒方干预模型大鼠,研究“气虚染毒”病机与鼻咽上皮细胞癌变启动和发展过程中细胞凋亡活性异常改变的相关性及其信号传导机理,确定不同凋亡信号传导通路中的关键基因；探讨益气解毒方诱导鼻咽上皮癌变细胞凋亡信号传导的主要通路及其主要环节相关责任基因的表达调控和干预靶点,验证对应性治疗法则“益气解毒”对“气虚染毒”病机所诱发鼻咽上皮细胞癌变病程的阻逆效应。方法研究工作分两步进行。1.二亚硝基哌嗪诱发力竭游泳大鼠鼻咽上皮细胞癌变(“气虚染毒”)的细胞凋亡信号传导通路研究健康雄性SD大鼠56只,随机分为模型组Ⅰ24只,模型组Ⅱ24只和空白对照组8只。模型组Ⅰ腋部皮下注射二亚硝基哌嗪(DNP)和氟波酯(TPA),模型组Ⅱ于进行力竭游泳的同时同组Ⅰ注射DNP和TPA,空白组同法注射用生理盐水稀释10倍的二甲基亚砜(DMSO),共注射28次。实验周期最长达到400天。定期分批处死大鼠,取鼻咽组织进行鼻咽癌变诱发过程中各阶段的病理组织学检查,以TUNEL法检测各阶段组织标本细胞凋亡活性,应用免疫组织化学SABC法检测各组织标本PCNA指数、细胞凋亡信号传到通路线粒体途径(Bcl-2、Bax、Cyt-C和Caspase-3)及NF-κBp65信号传导途径(NF-κBp65和IκB)的主要相关蛋白活性表达,并应用RT-PCR技术检测Bcl-2和Bax mRNA的表达,以验证相关指标免疫组化检测结果。2.益气解毒方治疗效应对大鼠鼻咽上皮细胞诱发性癌变过程中细胞凋亡信号传导通路的干预作用研究制备中药复方益气解毒方浓缩煎液。取健康雄性SD大鼠72只,随机分为3组,即模型组24只,给生理盐水灌胃作为阴性对照；实验组24只,以中药益气解毒方浓缩煎液灌胃作为药效的实验观察,处理持续时间90天；阳性对照组24只,以维甲酸灌胃作为阳性对照,处理持续时间同实验组。所有动物均按照第一部分模型组Ⅱ所用诱癌方法诱导鼻咽上皮细胞癌变进程,各组动物分别同时予以相应干预措施处理,同前分期分批处死动物,采集标本进行干预结果观察。检测指标与方法同上。结果1.二亚硝基哌嗪诱发力竭游泳大鼠鼻咽上皮细胞癌变(“气虚染毒”)的细胞凋亡信号传导通路特征随DNP诱导时间的延长,大鼠鼻咽上皮细胞病理变化日趋明显,最终发生恶变。在同一实验时段,模型组Ⅱ鼻咽上皮细胞病变发生率明显高于模型组Ⅰ,只是在同一病理阶段,所检测的基因表达活性在两组间的差异无统计学意义。在正常鼻咽上皮细胞和单纯性增生病理阶段,二者之间的细胞凋亡活性和PCNA蛋白表达活性差异均无统计学意义(P>0.05)。随着鼻咽上皮细胞癌变过程的进展,异型增生组织和癌变组织中的细胞凋亡活性降低；虽然该二阶段的细胞凋亡活性差异无统计学意义(P>0.05),但分别与之前的两个阶段比较,其差异都具有统计学意义(P<0.05)。异型增生组织和癌变组织中的PCNA蛋白表达活性增强,而且其间的差异具有统计学意义(P<0.05)；分别与之前的两个病理阶段比较,指标值差异也分别具有统计学意义(P<0.05)。在该一病理进程中,鼻咽上皮细胞的细胞凋亡活性和PCNA表达活性呈现明显的负相关关系(r=-0.794,P<0.05)。正常鼻咽上皮细胞和单纯性增生病理阶段,二者之间的Bcl-2、Cyt-C和Caspase-3蛋白表达活性差异都无统计学意义(P>0.05)。随着鼻咽上皮细胞病理变化的进展,异型增生组织和癌变组织中的Bcl-2蛋白表达活性增强,分别与之前的两个病理阶段比较,其差异均具有统计学意义(P<0.05),但异型增生和癌变阶段之间的检测指标差异却无统计学意义(P>0.05)。异型增生组织和癌变组织中的Cytochrome-C与Caspase-3蛋白表达活性减弱,分别与此前的两个病理阶段比较,其差异均具有统计学意义(P<0.05),但异型增生和癌变阶段之间的检测指标差异却无统计学意义(P>0.05)。随着鼻咽上皮细胞诱发性癌变进程的发展,Bax蛋白的活性表达程度呈现逐步降低趋势,但各病理阶段间的比较结果显示,其差异均无统计学意义(P>0.05)。进一步的相关分析提示,在此病理进程中,Bax蛋白活性与Bcl-2.Cytochrome-C和Caspase-3表达活性亦无明显的相关性关系(r分别为-0.157,0.196,0.334；P分别为0.593,0.501,0.243),但Bcl-2与Cytochrome-C和Caspase-3的表达活性之间则呈现明显的负相关(r分别为-0.668,-0.871；P<0.05),Cytochrome-C与Caspase-3的表达活性又呈明显的正相关(r=0.698,P<0.05)。同时,在同一病理阶段,Bax mRNA与Bcl-2 mRNA的转录活性与各自蛋白的表达活性也是相平行的。在正常鼻咽上皮细胞和单纯性增生病理阶段,二者之间的NF-κBp65和IκBα蛋白表达活性差异均无统计学意义(P>0.05),但NF-K B p65蛋白在异型增生组织和癌变组织中的表达活性都增强,而且该二病理阶段之间的指标值差异还具有统计学意义(P<0.05)；分别与此前的两个病理阶段比较,指标值差异也具有显著性意义(P<0.05)。在异型增生组织和癌变组织中,IκBα蛋白的表达活性都减弱,只是二者之间的检测值差异无统计学意义(P>0.05)；但分别与此前的两个病理阶段比较,其差异值却具有显著性意义(P<0.05)。相关分析显示,在大鼠鼻咽癌变病理进程中,NF-KBp65表达活性与1 K Bα表达活性呈现显著的负相关关系(r=-0.541,P<0.05)。2.益气解毒方对大鼠鼻咽上皮细胞诱发性癌变过程中细胞凋亡信号传导通路的干预作用灌服益气解毒方浓缩煎液的实验组大鼠中,鼻咽上皮组织的癌变率为0%(0／5),明显低于生理盐水对照组的86.3%(5／6)。虽然维甲酸组阳性对照组大鼠的发癌率也为0%(0／5),但该组所有动物均于实验周期的第250～310d间逐渐死亡,显示该药具有明显的毒副作用。在诱发性鼻咽上皮细胞癌变进程中的单纯性增生阶段,3组大鼠的鼻咽上皮细胞凋亡活性和PCNA蛋白表达活性组间差异均无统计学意义(P>0.05)；在异型增生阶段,益气解毒方组鼻咽上皮细胞凋亡活性明显高于模型组(P<0.05), PCNA蛋白表达活性则显著低于模型组(P<0.05)。在诱发性鼻咽癌变进程的单纯性增生阶段,分别比较3组大鼠鼻咽上皮细胞的Bcl-2、Bax、Cytochrome-C和Caspase-3蛋白表达活性,其组间差异均无统计学意义(P>0.05)。而在异型增生阶段,益气解毒方组鼻咽上皮细胞的Bcl-2蛋白表达活性显著低于模型组(P<0.05), Cytochrome-C知Caspase-3蛋白表达活性又分别显著高于模型组(P<0.05)；Bax蛋白表达活性虽然高于模型组,但比较分析结果表明,组间差异却无统计学意义(P>0.05)。在同一病理阶段,各组鼻咽上皮细胞的Bax mRNA和Bcl-2 mRNA转录活性与各自蛋白的表达活性呈现平行趋势。在诱发性鼻咽癌变进程的单纯性增生阶段,3组大鼠鼻咽上皮细胞的NF-κB p65和IκBα蛋白表达活性均未出现显著性变化(P>0.05),但在异型增生阶段,益气解毒方组鼻咽上皮细胞的NF-κBp65蛋白表达活性显著低于模型组(P<0.05),而IκBα蛋白表达活性显著高于模型组(P<0.05)。结论1.气虚体质状态可能是环境致癌因素诱发性鼻咽癌发病过程的遗传易感性体质因素,接受诱癌物质作用后,便可启动鼻咽癌变病理进程,即“气虚染毒”病机假说是能够成立的。2.大鼠鼻咽上皮细胞的诱发性癌变的病理进展过程,与靶器官的细胞凋亡活性异常降低、细胞增殖活性过度升高有关,病理机制涉及细胞凋亡信号传导通路的线粒体途径和NF-κB途径信号传导异常。3.中药益气解毒方能够有效阻逆由“气虚染毒”病机诱发的大鼠鼻咽上皮细胞癌变进程。该一阻逆效应的发挥,可能与其有效抑制病变组织过度升高的细胞增殖活性并强力诱导其细胞凋亡活性有关。其诱导细胞凋亡活性效应,可能是通过干预细胞凋亡信号传导通路的线粒体途径和NF-κB途径而实现的。4.研究结果提示,二亚硝基哌嗪诱发力竭游泳大鼠鼻咽上皮细胞癌变技术,能够较好地模拟“气虚染毒”这一中医病机,由此制备的鼻咽上皮细胞癌变动物模型,可以比较有效地应用于验证鼻咽上皮细胞癌变的“气虚染毒”中医病机假说。而在此基础上设计的中药益气解毒方干预试验,不仅可以进一步反证“气虚染毒”病机假说的合理性,还可以由此而建立该一病理变化的“益气解毒”治疗法则。