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谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD),是能够将谷氨酸(Glutamate,L-glu)转化成 γ-氨基丁酸的唯一酶。γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid,GABA),是生物体内广泛存在的一种非蛋白氨基酸,具有许多重要的生理功能,如降低血压、镇静和预防老年痴呆等,因此,GABA在制药、食品、保健等行业存在巨大的应用潜能。目前,国内产GABA野生菌株能力较低,同时,在发酵生产过程中,GAD的最适pH偏低,普遍在4.0-5.0之间,当pH达到6.0时,酶就因解聚而失活,不利于工业应用。因此,为了得到能够高产GABA的菌株和拓宽GAD的pH适应范围,本研究从泡菜样品中筛选高产GABA的菌株,优化其发酵条件,同时在体外对GAD分子进行改造。主要研究内容和结果如下:1.高产GABA菌株的筛选鉴定。本研究以自贡地区的酸菜为样品,以乳酸菌产酸分解含有碳酸钙的MRS培养基形成溶钙圈为依据,初步筛选出乳酸菌,再通过TLC和HPLC法筛选出4株能够产GABA的菌株,对4株产GABA的菌株分别进行发酵培养,以产GABA的标准菌株CICC22144为对照,检测到其GABA的产量分别为 0.736g/L,0.691g/L,1.11g/L 和 1.92 g/L。对产量最高的 Liulab84菌株进行形态学、生理生化和16S rDNA分子生物学鉴定,结果表明其为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),命名为 Lactobacillus plantarum LC84。2.菌株产GABA发酵条件优化。通过单因素和正交试验,进行发酵条件优化后,结果表明A3B2C1D3为最优组合,即L.plantarum LC84的最优发酵条件确定为:发酵温度39℃,pH6.0,接种量4%,发酵时间60h,测得GABA的含量为3.83 g/L,。3.谷氨酸脱羧酶基因的克隆表达。利用分离得到的L.plantarum LC84作为出发菌株,得到其中的GAD基因亚克隆,与pET28a(+)质粒连接,构建重组质粒pET28a-gad在E.coli BL21(DE3)中进行表达,分离纯化,检测其酶学性质。结果表明,来自不同物种的谷氨酸脱羧酶,在碱基序列上也存在较大的差异。SDS-PAGE电泳分析检测表达了一个约53KDa的可溶性蛋白。对得到的蛋白进行纯化,检测其酶活和基本的酶学性质,谷氨酸脱羧酶的酶活最适pH为4.8,最适温度在45-50℃之间,最适辅酶磷酸哔多醛(PLP)的添加量为50μm/L,研究中添加的金属离子对酶活都没有明显的促进作用,相反,Cu2+和Ag+对酶活具有强烈的抑制作用,Ag+几乎使GAD酶失活。4.谷氨酸脱羧酶的分子改造。为拓宽GAD的pH适应性,利用同源建模的方法对其进行分子改造。采用DPn1的方法,对野生谷氨酸脱羧酶成功进行了定点突变,成功将294位点的天冬氨酸(ASP)突变为甘氨酸(Gly),307位点的丝氨酸(Ser)突变为天冬酰胺(Asn),312的位点谷氨酸(Glu)突变为丝氨酸(Ser),346的位点谷氨酰胺(Gln)突变为组氨酸(His),进过突变之后,E312S突变体,在pH4.8条件下,酶活为野生型的1.6倍左右,在pH6.2时,突变体酶活相比于野生型提高了 5倍左右,在4.8-5.8范围内,酸性稳定性保持60%以上。Q346H突变体,在pH4.8条件下,酶活稍高于野生型,在pH6.2处,其酶活提高了 2倍左右,在4.8-5.8范围内,Q346H突变体,保持40%以上酶活性。综上,从酸菜中获得了野生产GABA的植物乳杆菌,通过对其发酵条件进行优化,最大限度地发挥菌种生产GABA的性能,同时对植物乳杆菌中的GAD,利用基因工程手段进行外源表达,在此基础上,进行定点突变,拓宽了该酶的反应pH,为GAD酶学性质的改造提供依据,同时为生产GABA的工业应用中降低生产和设备损耗成本奠定基础。