流行性感冒是一种由流感病毒引起的上呼吸道传染病。流感极易在人群中传播，历史上几次流感的大流行都造成成千上万人死亡。流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，甲型流感又包含15个血凝素(hemagglutinin，HA)亚型和9个神经氨酸酶(neuraminidase，NA)亚型，其中常引起人群发病的是甲型流感病毒中的H1N1和H3N2。 登革病毒(denguevirus，DV)感染是一种重要的蚊媒传染病，主要流行于热带、亚热带地区。DV包括4个不同血清型，即登革1、2、3、4型病毒(DV1～4型)。受登革病毒感染后初期症状可能类似一般感冒，少数病例会发展到严重可致死的登革出血热(Denguehaemorrhagicfever,DHF)／登革休克综合征(dengueshocksyndlone,DSS)。全球每年有大约0.8～1亿登革热和25～50万登革出血热或登革休克综合征患者。 乙型脑炎是由乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitis，JEV)引起，经蚊虫叮咬传播的一种传染性疾病，该病能引起严重的脑炎，往往会导致永久性大脑损伤，死亡率高。全球每年大概有16000例以上的乙型脑炎患者，约5000例的死亡报告，并且30％-50％的病愈患者会有不同程度的神经系统后遗症。该病主要分布于亚洲地区。 黄热病曾在南美洲、非洲等热带地区引起大范围的流行，该疾病是由黄热病毒(yellowfevervirus，YFV)引起，其临床表现差别悬殊，轻型仅为自限性发热，重型可发展至严重的肝炎和出血热。每年估计有200，000例黄热病患者(30，000例死亡)。 上述传染性病毒在感染早期通常临床症状相似，难以实现早期临床诊断，并且大多数的传染性病毒感染目前尚无有效手段阻止或延缓病程发展，因此早期实验室检测对于迅速做出诊断，确立正确及时的治疗方案、避免误诊、贻误病程和控制疫情有重要意义。 目前针对病毒感染的实验室检测往往依赖于病毒分离培养、核酸检测(如PCR)和血清学检测(如ELISA)等方法。多数病毒检测方法主要用于单一致病因子的鉴定，并且都存在不足之处。基因芯片技术代表着分子技术领域的最新发展，具有快速诊断和敏感的核酸分析能力。该技术在微生物分析、病原体检测、基础和应用环境科学的监控等方面都具有广阔的应用前景。 本研究首先运用生物信息学软件如BLAST、Oligo6.0、DNAClub，筛选出特异性高、长度一致、Tm值相近的寡核苷酸探针，经BLAST比对排除非特异性探针，分别针对H1N1、H3N2、DV1、DV2、DV3、DV4、JEV和YFV设计并合成了62条寡核苷酸探针，用于点样制备寡核苷酸芯片。采用K562细胞、乙型肝炎病毒质粒、丙型肝炎病毒质粒和丁型肝炎病毒质粒作为阴性对照样品。从省疾病预防控制中心取回的甲型流感H1N1、H3N2、DV1～4病毒株中提取的RNA样品和克隆有JEV、YFV基因的质粒样品用于验证探针。采用限制性荧光标记技术进行全基因组扩增标记，标记产物纯化后与芯片进行杂交，并根据杂交结果筛选出与相应病毒样品的杂交信噪比高于2.5，且与其它病毒样品无非特异性杂交信号的寡核苷酸探针，得到22条高灵敏性、高特异性的寡核苷酸探针。 本课题通过实验室研究，得到以下实验结果： 1.通过实验排除了非特异性杂交的探针以及存在空间位阻的探针，最终确定从62条探针中，选用了22条探针进行临床样品验证。 2.优化寡核苷酸芯片实验条件。结果表明，探针浓度调整为1μg/μL。杂交温度42℃，杂交时间4h，杂交液含50％甲酰胺，10×SSC，0.2％SDS为寡核苷酸芯片最适的实验条件。 3实验中新样品加接头后再次引入限制件酶切，该步骤能有效的去除可能的污染片段，而新加上接头的样品片段由于有甲基化保护，不会被酶切，从而可以避免实验过程中假阳性结果的产生。 4.为了监测芯片检测的过程中是否存在人为的操作失误以及降低芯片检测的假阳性率和假阴性率，研究中芯片阵列设计引入2条GFP寡核苷酸探针作为阳性外对照，实验中将由重组载体上获得的GFP基因的RNA、DNA片段和各病毒样品混合后分别用限制性显示技术扩增标记，将标记的样品与芯片杂交，完成芯片的扫描及结果分析。结果表明，阵列设计中引入阳性外对照探针能为基因芯片的检测过程提供有效的质控。 5.临床样品的检验研究。研究中应用寡核苷酸芯片对41例临床样品和疫苗株样品(JEV、YFV)进行了检测。其方法是：从样品中抽提出病毒RNA，与GFP基因的RNA样品混合后，逆转录并用限制性显示标记技术使样品标上荧光物质，与包含有实验中筛选出的22条高灵敏性、高特异性的寡核苷酸探针及2条GFP阳性外对照探针的芯片进行杂交，芯片洗脱、扫描后采用GenePixPro6.0软件进行结果分析。同时实验中设计了多对引物，通过多重逆转录PCR临床样品进行鉴定，并与芯片的检测结果相对照。杂交结果表明，芯片的特异性和灵敏度均较高，在这41例临床样品中，甲1型流感有6例，甲3型流感有2例，DV1有3例，DV2、DV3和DV4各1例，与多重逆转录PCR_的实验结果相一致。 综上所述，研究中我们将限制性显示PCR与基因芯片技术相结合，选择以流感病毒、登革病毒、乙型脑炎病毒和黄热病毒四种病原体为主要研究对象，研究制备传染性病毒联合检测基因芯片，为将该技术运用予多种病原体临床检测打下基础。