宫颈癌是严重的威胁妇女健康的常见恶性肿瘤之一,它的发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中高居首位,在全球女性恶性肿瘤中居第3位。我国每年宫颈癌新发病例约为10万,死亡病例约3万。高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus,hrHPV)的持续性感染是引起宫颈癌发生的主要原因,但只有少部分hrHPV感染者最终发展为宫颈癌,因此从感染HPV到宫颈癌发生是一个含其他因素共同作用、涉及多基因、多阶段的发展过程。早期宫颈癌在我国的主要治疗方式为手术治疗,放化疗不仅是宫颈癌术后的传统治疗方法,而且是晚期患者及复发患者的主要治疗方式。但放化疗常常引起严重的全身不良反应,从而导致患者依从性降低,而放疗抵抗可致治疗失败。因此,寻找与宫颈癌发生发展相关的分子靶点,探索指导宫颈癌特异性治疗的新指标,进一步提高患者生存率是我们亟待解决的问题。肿瘤的发生与发展是一个非常复杂且涉及多种基因共同参与的过程,这一过程中,原癌基因的异常激活以及抑癌基因的异常失活等诸多因素均可以引起细胞的表观遗传学发生改变,使得机体在基因水平失去对细胞生长的正常调控能力,从而诱导无限制增生与分化的发生进而形成肿瘤。随着分子生物学技术在近几年的迅猛发展,生命科学工作者们对与肿瘤发生关系比较密切的多种基因例如周期与凋亡相关基因、侵袭与转移相关基因、耐药相关基因以及信号传导系统等的研究越来越深入,虽然宫颈癌病因相对比较明确,但其发生发展的具体生物学机制仍有待挖掘,筛选癌细胞恶性增殖过程中的潜在分子靶点对深入研究这一疾病的发病机制具有重大意义。核受体共激活因子5(nuclear receptor coactivator 5,NCOA5),也被称为不依赖激活功能-2(activation function-2,AF-2)结构域的核受体共激活因子(coactivator independent of AF-2 function,CIA),定位于人染色体 20q 13.12,编码分子量为65kDa的核蛋白。核受体是一种配体依赖性的转录因子,参与对机体生长发育和繁殖的调控。NCOA5属于调控激素调节生理途径功能的转录因子超家族,此超家族的成员被证实可以通过对共活化剂和共抑制剂的补充来对靶基因的表达进行促进或抑制。近年来,NCOA5在多种肿瘤组织中的异常表达越来越受到重视,它在食管癌组织中表达下调,并且与食管恶性肿瘤的生长、浸润、转移以及预后密切相关。敲除NCOA5基因可引起雄性小鼠的肝细胞发生炎症性改变、出现异型性最终导致肝癌的发生。NCOA5在卵巢癌组织中高表达,并且受NOTCH3调控,而它在正常卵巢组织中低表达,并且与肿瘤的不良预后密切相关。也有研究证实,NCOA5 作为 Tat 相互作用蛋白 3 0(Tat interacting protein 30,TIP30)的作用靶点可以调控c-Myc表达,它被认为通过对细胞周期相关蛋白的调节从而影响肿瘤细胞的多种恶性生物学行为如增殖能力及侵袭能力等。由于NCOA5在多种肿瘤细胞中表现出的特征,它被认定为肿瘤潜在的预测因子以及靶向治疗的新目标。综上所述,NCOA5参与多种肿瘤的进展及预后,然而它在宫颈癌中的具体作用仍不明确,于是我们以此为出发点进行研究,主要研究内容分为以下三部分:第一部分,探究NCOA5在子宫颈癌患者中的表达情况并进一步分析它和宫颈癌的诸多临床病理特征以及预后的关系;第二部分,通过对人宫颈癌细胞系中内源性NCOA5表达水平的干预研究NCOA5对宫颈癌细胞系各种恶性生物学行为的影响;第三部分,通过基因水平的检测来探究NCOA5可能的作用机制并对其临床应用潜能进行探索。第一部分NCOA5在宫颈癌中的表达目的:检测NCOA5在宫颈病变组织中的表达情况,探究NCOA5的表达与患者临床病理特征及预后的相关性。方法:对Oncomine数据库中符合条件的基因芯片数据进行整合分析;采用逆转录聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测 37例配对的新鲜宫颈癌及癌旁组织中NCOA5信使RNA(Messenger RNA,mRNA)的表达;采用western blot方法检测71例配对的新鲜宫颈癌及癌旁组织中NCOA5蛋白的表达;采用免疫组织化学方法检测93例宫颈癌蜡块组织中NCOA5蛋白的表达;Wilcoxon配对秩检验比较宫颈癌组织及相应的癌旁正常宫颈组织中NCOA5 mRNA和NCOA5蛋白的表达情况;卡方检验分析NCOA5表达水平与宫颈癌临床病理特征的关系;双尾Spearman检验法分析NCOA5和多个临床病理特征的相关性;秩和检验Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线并分析比较总体生存期和无进展生存期的差别;单因素和多因素Cox回归分析宫颈癌患者预后的独立影响因素并且计算95%风险比和95%置信区间。此外,通过独立样本t检验或双变量分析进行组间比较。结果:1.Oncomine数据库中基因芯片数据提示NCOA5 mRNA在人宫颈鳞状细胞癌组织中的表达量显著低于其在正常宫颈组织中的表达量。我们的实验结果证实与癌旁正常宫颈组织相比,宫颈癌组织中NCOA5 mRNA的表达量显著降低,差异具有统计学意义(P=0.0028);与癌旁正常宫颈组织相比,宫颈癌组织中NCOA5蛋白的表达量显著降低,差异具有统计学意义(P<0.0001)。约在79%(56/71)宫颈癌样本中可以观察到NCOA5蛋白表达的降低。2.NCOA5定位于宫颈癌组织的细胞核。在我们进行随访的93例宫颈癌患者中,40例为NCOA5低表达,占总样本43%。NCOA5的表达与宫颈癌FIGO临床分期(P=0.043)和组织学分化程度(P=0.01 8)关系密切,而与患者年龄(P=0.736)、组织学类型(P=0.185)、浸润深度(P=0.82)、淋巴结是否转移(P=0.2)及肿瘤直径(P=0.236)无明显相关性。与FIGO I期及中分化宫颈癌相比,NCOA5蛋白在II期及低分化宫颈癌中的表达量更低。3.与NCOA5高表达患者相比,NCOA5低表达患者的总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)较对照组明显缩短,差异具有统计学意义(P=0.0048,P=0.0197)。4.应用Cox比例风险模型评估NCOA5的预测价值,结果提示NCOA5低表达与宫颈癌的死亡风险增加相关(P=0.009)。多因素Cox回归分析证实NCOA5表达是评价宫颈癌预后的独立因素(P=0.032)。结论:1.NCOA5在癌旁正常宫颈组织中表达量较高,而在对应的宫颈癌组织中表达量较低,提示NCOA5的缺失参与了宫颈癌的发生过程。2.NCOA5低表达与宫颈癌的部分临床病理特征相关,提示NCOA5的缺失参与了宫颈癌的发展过程。3.NCOA5低表达影响宫颈癌患者的预后,是评价宫颈癌预后的独立因素。第二部分NCOA5的表达对人宫颈癌细胞系生物学行为的影响目的:探究NCOA5表达对人宫颈癌细胞系增殖、迁移、侵袭能力及周期分布的影响。方法:通过慢病毒感染人宫颈癌细胞系进行NCOA5蛋白表达的上调和下调,经qRT-PCR及western blot法检测并确认作用效率之后,利用CCK8法检测NCOA5表达水平对宫颈癌细胞系体外增殖能力的影响;通过裸鼠成瘤实验检测NCOA5表达水平对宫颈癌细胞系体内增殖能力的影响;Transwell小室法测定NCOA5表达水平对细胞迁移及侵袭能力的影响;流式细胞仪检测NCOA5表达水平对细胞周期分布的影响;western blot法检测迁移、侵袭及周期等相关蛋白表达的变化。结果:1.NCOA5蛋白在HeLa细胞中表达量较高,而在CaSki细胞中表达量较低。设计并合成慢病毒颗粒分别对这两种细胞系中内源性NCOA5蛋白表达进行下调和上调,HeLa细胞经慢病毒感染后NCOA5蛋白表达显著下降,而CaSki细胞经慢病毒感染后NCOA5蛋白表达明显升高。2.体外实验证实NCOA5基因沉默后细胞增殖能力明显增强,而过表达NCOA5基因后细胞的增殖能力显著下降,差异均具有统计学意义。裸鼠移植瘤实验提示,与阴性对照组细胞相比NCOA5下调组细胞拥有更强的成瘤能力,过表达NCOA5后细胞的成瘤能力明显下降。3.NCOA5基因沉默后细胞的迁移能力及侵袭能力显著增强,而获得性高表达NCOA5之后,细胞的迁移、侵袭能力明显下降。获得性高表达NCOA5基因后,CaSki细胞系中E-cadherin的表达量明显增加。4.利用流式细胞仪对各组细胞的周期分布进行检测,获得性高表达NCOA5后CaSki细胞G1期细胞比例明显增高,而S期细胞比例显著减少;NCOA5基因沉默后,HeLa细胞G1期明显减少,S期增多,差异均具有统计学意义(P<0.05)。获得性高表达NCOA5导致细胞周期素E2(Cyclin E2)表达显著降低,而NCOA5基因沉默后,细胞周期素Dl(Cyclin D1)和Cyclin E2的表达显著升高。结论:1.过表达NCOA5能够抑制人宫颈癌细胞系的增殖能力,而下调NCOA5则明显增强宫颈癌细胞的增殖能力。2.NCOA5能够抑制人宫颈癌细胞的迁移和侵袭。3.NCOA5通过对周期相关蛋白的表达进行调控从而影响宫颈癌细胞周期的进展。第三部分NCOA5作用机制及对宫颈癌细胞顺铂敏感性的影响目的:结合基因芯片技术检测NCOA5可能的作用机制并探索NCOA5在临床上的潜在应用价值。方法:稳定下调NCOA5的HeLa细胞和阴性对照HeLa细胞各选择三个样本进行基因表达谱分析,对得到的数据进行处理,筛选差异表达基因,进行基因表达趋势的显著性功能定位和信号通路富集分析,明确NCOA5作用的信号通路并选择相应的下游目的基因进行验证,通过对差异基因的进一步分析发现NCOA5在临床应用的潜在可能,并通过体外实验进行初步验证。结果:1.NCOA5下调后被激活的经典通路包括:Rho家族GTP酶信号通路,RhoA信号通路和Wnt/β-catenin信号通路,被抑制的经典通路包括:Glioma信号通路,Th2通路,内源性凝血酶激活通路,胰腺癌信号通路,白细胞渗出信号通路和STAT3通路。2.下调NCOA5后RhoA信号通路相关基因和蛋白的表达水平均明显升高,变化趋势与基因表达谱芯片的检测结果一致。此外,下调NCOA5还导致了 MCM6、MSH2、HMGA2的显著升高和RPRM的显著降低。3.CCK8检测结果提示下调NCOA5后,HeLa细胞对顺铂的敏感性增加,而上调NCOA5后CaSki细胞对顺铂的敏感性降低。4.流式细胞仪分析凋亡染色的细胞,结果提示加入顺铂后NCOA5下调组细胞的早期凋亡率(P<0.0001)、晚期凋亡率(P=0.0076)和总凋亡率(P<0.0001)均明显高于对照组,NCOA5过表达组细胞的早期凋亡率(P=0.0465)和总凋亡率(P=0.05)明显低于对照组。结论:1.NCOA5可能通过激活RhoA信号通路和Wnt/β-catenin信号通路影响宫颈癌的恶性生物学行为。2.干扰NCOA5能够提高宫颈癌细胞对顺铂的敏感性,可能为宫颈癌靶向治疗提供新方向。