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肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC,以下简称肝癌)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和病死率分居全球恶性肿瘤的第5位和第3位。肝癌发病隐匿,早期诊断困难,预后差且极易转移复发,这也严重影响了肝癌的治疗效果。肝癌发生发展及转移复发的分子机制复杂且尚未完全清楚。MiRNA是近年来在真核生物体内发现的一种非编码的单链小分子RNA,miRNA高度保守,在体内主要起转录后负调控作用。研究已证实miRNA在肝癌的发生发展过程中起着重要作用。MiR-709在多种器官组织如脑、淋巴结、心脏、肺、肝脏和肾脏中含量丰富。MiR-709在肝癌中的作用还未见报道。因此,miR-709在肝癌的发生发展过程中的功能作用及其机制值得我们深入去研究。目的:探究miR-709在HCC发生发展过程中的作用。方法:运用qRT-PCR检测肝细胞、肝癌细胞、肝癌组织及癌旁正常组织检测miR-709水平,分析miR-709与肝癌临床病理特征间关系。将miR-709 mimic和miR-709 inhibitor转染到肝癌细胞中,检测miR-709的表达,分别采用CCK-8增殖实验、Transwell迁移实验和western blot实验检测转染后肝癌细胞株的增殖、周期、迁移及侵袭能力的变化情况。然后通过运用生物信息学软件进一步检测miR-709的靶基因,然后通过荧光素酶报告基因检测系统、qRT-PCR以及western Blot等方法验证miR-709的作用靶点。结果:(1)①MiR-709在肝癌细胞中表达上调:通过应采用qRT-PCR检测miR-709水平在肝癌细胞(HepG2,、SMMC7721、Hep3B和Bel7402)和肝细胞HL-7702间表达水平发现,miR-709在肝癌细胞中表达明显上调;(2)MiR-709在肝癌组织中表达上调:对6对研究的肝癌组织和其癌旁正常组织中的miR-709进行初步筛查发现肝癌组织中miR-709水平上调表达。然后对纳入的50对肝癌组织及其癌旁正常组织中的miR-709进行检测发现,miR-709在肝癌组织中表达明显上调(P<0.001)。在50例肝癌病人中,有40例(80%)肝癌病人的miR-709在肝癌组织中的水平明显高于其癌旁正常组织。我们研究发现,高表达的miR-709和肝癌的pTNM分期、侵袭及转移呈正相关。(2)(1)过表达miR-709可促进肝癌细胞增殖:将miR-709 mimic and inhibitor成功转染到肝癌细胞内,运用CCK-8实验检测肝癌细胞增殖发现下调miR-709可抑制肝癌细胞增殖,转染miR-709 mimic可促进肝癌细胞增殖;对Ki-67蛋白及其mRNA水平检测发现转染miR-709 mimic可促使细胞增殖,而转染miR-709 inhibitor则抑制增殖。(2)过表达miR-709可促进肝癌细胞的转移及侵袭:与转染miR-709 inhibitor肝癌细胞相比,转染miR-709 mimic过表达miR-709可促进肝癌细胞的转移及侵袭。(3)GPC5是miR-709作用的靶基因:通过PicTar和TargetScan生物信息学软件预测发现,miR-709可和GPC5 3’-UTR互补配对。将野生型和突变型GPC5 3,UTR克隆植入荧光素酶报告质粒中,分别构建野生型(WT)和突变型(Mut)的荧光素酶报告质粒并与miR-709 mimic和Scramble转染到肝癌细胞中对萤光素酶活性进行检测,以明确miR-709与其靶基因3’UTR间的相互作用。在肝癌细胞HepG2细胞,转染miR-709 mimic对基因GPC5的野生型3’UTR报告基因质粒的萤光素酶的活性有明显的抑制作用(P<0.001);但对基因GPC5的突变型3’UTR报告基因质粒的萤光素酶活性没有明显的影响。基因GPC5是miR-709的直接作用的靶基因,miR-709能直接与GPC5的3’UTR靶向结合,发挥抑制其表达的作用。转染miR-709 mimic可以明显抑制HepG2细胞的GPC5蛋白和mRNA的表达。将pcDNA质粒、pcDNA-GPC5质粒、pcDNA-GPC5+miR-709转染HepG2细胞检测对肝癌细胞的增殖和侵袭能力的影响,转染pcDNA-GPC5质粒后的肝癌细胞的增殖和侵袭能力明显减弱,转染pcDNA-GPC5+miR-709质粒后的肝癌细胞的增殖和侵袭能力明显提高。结论:MiR-709在肝癌组织中可上调表达,过表达的miR-709与肝癌的pTNM分期正相关。进一步研究发现miR-709靶向作用GPC5基因可促使肝癌细胞的增殖、转移及侵袭。