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臭氧(O3)是大气中一种正常的组分,存在于平流层和对流层中高层大气中的臭氧对地球上生物有保护作用。但臭氧在接近地面地方对生物有害,是一种污染物。随着科技的进步和工业的快速发展,地面臭氧浓度逐年提高,对生物,特别是植物的影响越来越大,引起了植物的产量和品量下降,同时对植物中遗传物质具有损伤作用。次生代谢产物的积累是植物响应臭氧胁迫的防御方式之一,黄酮类物质是植物中一类重要的次生代谢产物,可以清除活性氧自由基,保护细胞结构,抑制脂质过氧化等,抵御臭氧对植物的损伤。因此,植物体内黄酮类物质的合成积累对提高植物的臭氧耐性具有重要影响。NO是植物中一种新型的信号分子。研究报道表明NO在植物信号调控方面起着非常重要的作用,参与了包括黄酮在内的植物次生代谢产物合成的调控过程。植物在臭氧胁迫下会产生NO。然而,目前对NO是否参与臭氧胁迫下黄酮类次生产物的合成调控制过程以及臭氧胁迫下NO产生的机制等问题尚无详细研究报道。在本实验中,我们以银杏叶细胞为材料,在对细胞培养条件进行优化的基础上,研究了臭氧胁迫对银杏叶细胞中黄酮的合成和NO的产生的影响,并考察了NO在臭氧诱导黄酮合成中的功能以及硝酸还原酶(NR)在臭氧胁迫诱发NO产生过程的作用,主要结果如下：1、培养基对银杏细胞生长的影响。选择银杏悬浮细胞生长迅速的MS培养基,添加0.5mg/L NAA、1.0mg/L BA、0.1mg/L2,4-D (?)的激素,30mg/L的蔗糖优化培养基。2、培养条件对对银杏细胞生长的影响。选择pH5.9、25℃、100r/min优化银杏悬浮细胞培养条件3、高产银杏细胞系的选择。选择了培养6d的新鲜、疏松程度适当、分散均匀、生长态势好的银杏高产细胞进行试验。4、臭氧诱导对银杏细胞中黄酮类物质合成积累的影响。将培养了6d的的银杏叶细胞用臭氧处理后测定银杏叶细胞黄酮类物质的含量,结果显示处理后15h到35h内,与对照组相比,黄酮的产量显著提高,其中臭氧处理30h时,黄酮的产量达到最高,是对照组的3.2倍。表明臭氧处理可以诱发银杏细胞中黄酮类物质合成积累。5、不同浓度的臭氧对银杏细胞中黄酮类物质合成积累的影响。将培养了6d的银杏细胞用50nl/L、100nl/L、150nl/L三种不同浓度的臭氧处理30h后测定银杏细胞黄酮类物质的含量,结果表明黄酮类物质含量分别是对照的1.2倍1.9倍和3.1倍。6、臭氧诱导对银杏细胞中NO含量的影响。将培养了6d的的银杏细胞用150nl/L的臭氧处理后测定银杏叶细胞NO含量,结果显示处理后Oh到35h内,NO含量迅速提高,其中臭氧处理15h时,NO含量提高达到最大,为对照的16倍,表明臭氧处理可以提高银杏细胞中NO含量。7、NO淬灭剂(cPTIO)对臭氧诱发银杏细胞黄酮合成的抑制作用。在臭氧处理前20min加入cPTIO (0.5mmol/L),30h后测定银杏细胞黄酮含量。结果表明,加入cPTIO可以显著抑制臭氧对银杏细胞中黄酮合成积累的诱导作用。实验结果同时表明,cPTIO本身对银杏细胞中黄酮合成积累无显著影响。因此,上述试验结果表明NO是臭氧诱发银杏细胞中黄酮合成积累所必需的信号分子。8、臭氧处理对银杏细胞中硝酸还原酶(NR)活性的影响。将培养了6d的的银杏细胞用150nl/L的臭氧处理后测定银杏叶细胞NR活性,结果显示处理后0h到35h内,以未经臭氧处理的银杏细胞为对照,NR活性显著提高,其中臭氧处理10h时,NR活性提高达到最大,为加了对照的3.9倍,表明臭氧处理可以提高银杏细胞中的NR活性。9、硝酸还原酶抑制剂对臭氧诱导银杏细胞NO合成的影响。在臭氧处理前20min加入两种硝酸还原酶抑制剂TUN(0.1mol/L)和Gln(20mmol/L),10h和15h后分别测定银杏细胞NR活性和NO含量。结果表明,TUN和Gln在抑制银杏细胞中NR活性的同时还显著抑制了臭氧对银杏细胞中NO产生的诱导作用。试验结果表明臭氧胁迫诱发银杏细胞中NO的产生对NR具有依赖性,即臭氧可能依赖NR途径诱导银杏细胞中NO的产生。10、硝酸还原酶抑制剂对臭氧诱导银杏细胞黄酮合成的影响。在臭氧处理前20mmin加入两种硝酸还原酶抑制剂TUN (0.1mmol/L)和Gin(20mmol/L),30h后测定银杏细胞中黄酮含量,考查NR在臭氧诱导细胞黄酮合成的作用。结果表明,TUN和Gln处理可以显著抑制臭氧对银杏细胞中黄酮合成积累的诱导作用,表明NR参与臭氧诱发银杏细胞中黄酮合成的调控过程。由于本文试验结果证实NR可以介导臭氧诱发银杏细胞中NO产生,而NO是臭氧诱导银杏细胞黄酮合成所必需的信号分子,因此,推测NR通过介导NO的产生而参与臭氧对银杏细胞中黄酮合成的调控11、硝酸还原酶抑制剂对臭氧诱导银杏细胞中黄酮合成抑制作用可以通过加入NO供体硝普钠(SNP)解除。在臭氧处理前20mim以NO供体硝普牛钠(SNP,10μmol/L)和NR抑制同时处理银杏细胞,30h后测定银杏细胞中黄酮含量,考查外源添加NO对TUN和Gin对臭氧诱导银杏细胞黄酮合成抑制作用的影响。结果表明,添加10μmol/L SNP后细胞中黄酮含量分别增加了64.4%、52.2%,说明添加外源NO可以逆转NR抑制剂对银杏细胞中黄酮合成积累的抑制作用。实验结果进一步证实NR通过介导NO产生参与臭氧对银杏细胞中黄酮合成积累调控作用的推论。综上所述,本文试验结果表明臭氧胁迫下银杏细胞可以通过NR途径介导NO产生,而NO作为一种重要的信号分子参与臭氧对细胞中黄酮合成的促进作用,揭示了臭氧胁迫下植物细胞中黄酮类次生物质合成积累的一种新的调控机制。鉴于黄酮类物质在植物臭氧耐性的重要作用,本文研究结果对进一步研究探讨植物臭氧耐性机制及生产实践中提高植物的臭氧耐性,减少臭氧对植物的损害具有重要的理论和实际意义。