目的:巨大肩袖损伤很难采用单纯手术缝合技术来恢复肩关节的正常功能。随着患者对术后良好生理功能和生活质量需求不断提高,尤其重症肩关节退行性病变在中老年人群中多见,一旦发现巨大肩袖撕裂如果单纯行手术缝合,效果较差且再撕裂发病率很高,为了攻克这一技术缺陷,学者们采用了包括肌腱组织移植、肌腱转位等方法,这些技术的取得虽然在一定程度上重建肩袖稳定方面有了诸多进展,但该项技术相伴发的副作用有以下几个方面:改变了肩关节正常解剖和固有的生物力学性能;免疫排斥反应多发;生理功能恢复很差远远达不到日常生活的需要等等。因此,打破固有的单纯或改进式肩袖撕裂缝合技术这一僵化思维模式显得尤为重要,关于如何既能解决肩袖撕裂后的肌腱挛缩,又能很好地重建肩袖腱-骨界面正常解剖结构和恢复生理功能,最大程度上修复巨大肩袖撕裂成为本课题研究的关键。本研究希望通过动物实验,初步论证丝素蛋白生物补片修复巨大肩袖损伤,从而改进单纯手术缝合的不足;对腱-骨界面愈合效果作客观科学的评价以及实验支持。方法:第一部分:本实验选用了雄性、健康的新西兰大白兔共96只入组,随机分为以下4组,分别是:正常组、假手术组、高剂量组和低剂量组(高、低剂量组采用丝素蛋白生物补片干预)。行右前肢巨大肩袖撕裂造模,造模后的干预。术后8、16周随机分组并处死,立即取标本(n=12),立即行苏木素-伊红染色、三色染色以及苦味酸-天狼猩红染色观察腱-骨界面的组织形态学改变,病理处理取常温下新鲜的标本进行冰冻切片,即刻染色处理,避免因组织处理不当而引起的组织自溶,例如组织在低温-80℃冰箱中反复冻溶引起的组织自溶;ELISA方法检测:TGF-β1、IGF-1的蛋白表达以及水平变化。第二部分:再次选取96只健康、雄性新西兰大白兔入组,随机分为4组,分别是:正常组、假手术组、高剂量组和低剂量组(高、低剂量组采用丝素蛋白生物补片干预)。行兔右前肢巨大肩袖撕裂造模以及造模后的干预。术后8、16周随机分组,处死动物后立即取标本,行冈上肌腱生物力学检测以及统计对照分析(n=12),观察腱-骨界面的最大载荷(N)以及刚度值(N/mm)、弹性模量和位移数值的变化规律。结果:第一部分:组织形态转归情况:96只实验动物进行顺利,全部完成实验入组。标本取包括腱-骨界面在内的冈上肌腱,(1)HE和三色染色镜下观察,术后8周,假手术组和低剂量组的腱-骨界面及其附着周围被炎性细胞浸润,高剂量组腱骨间隙新生组织和毛细血管生长比较活跃,视野见少量炎性细胞,腱骨间少量纤维结缔组织包裹组织。术后16周,在高、低剂量两组的腱-骨界面间隙内发现有大量新生并长入的软骨组织与腱性组织连接,正常组中以成纤维母细胞数量多见,新生组织的比例比假手术组增多。高剂量组中见大量的胶原纤维和成纤维细胞,尤其腱-骨间隙显著增加并生长紧密厚实、排列更规则。低剂量组在肩袖组织缺损修复视野内可见少量增加的新生结缔组织连接。(2)Ⅲ型胶原结果显示:Ⅲ型胶原纤维尤其在高剂量组中占比例最多。镜下可见高、低剂量两补片组的Ⅲ型胶原纤维染色亮丽、分辨度较高,高剂量组在胶原着色深浅度以及区域面积大小上,分别在第8、16周时与低剂量组进行比较,统计学差异意义。正常组术后8周可见红色和亮白色的Ⅱ型胶原纤维,假手术组以Ⅱ型胶原纤维为主,亮白色多于红色,与正常组相比视野范围大;高剂量组主要见纤细的绿色Ⅲ型纤维,染色范围均较低剂量组深且均匀;低剂量组可见少量黄色的Ⅰ型纤维和绿色Ⅲ型纤维。高剂量组与低剂量组在术后16周时相比,Ⅲ型胶原染色阳性分布率在高剂量组中观察到更加明显,排列更加相对高度有序。高剂量组在术后16周比8周时明显增多,Ⅲ型胶原分布在高度有序化的基础上表现更为均匀非点状簇集。低剂量组中分布的Ⅱ型和Ⅲ型胶原纤维二者比例差别不明显,染色后观察排列相对有序。(3)TGF-β1、IGF-1蛋白水平测试结果:术后第8周,高剂量组的TGF-β1、IGF-1蛋白水平显著低于低剂量组和正常组。高剂量组中蛋白表达水平与其他3组比较有显著差异(P<0.05)。术后16周,高剂量组和低剂量组的TGF-β1蛋白水平有所上升,且显著高于假手术组(P<0.05)。高剂量组术后16周与正常组比较,IGF-1蛋白水平有所上升,有显著统计学差异(P>0.05)。正常组与假手术组比较,结果显示没有显著差异(P>0.05)。结果表明,丝素蛋白生物补片明显的促进了主要是腱-骨界面间隙的组织重建、结构修复;促进术后Ⅲ型胶原纤维的生长;有效地改善了 TGF-β1、IGF-1的蛋白表达水平;快速重建了巨大肩袖撕裂腱-骨界面中胶原纤维的再生,促进这一区域向致密结缔组织的转变,恢复肩袖正常生理功能。第二部分:取冈上肌腱作为标本,行生物力学测试,结果显示:4组分别在术后8、16周时比较,腱-骨界面的最大载荷值有统计学差异(P=0.000,P<0.05),高剂量组中腱-骨界面的最大载荷值,分别在术后两个时间节点与低剂量组、假手术组比较,有显著差异(P=0.000,P<0.05),高剂量组术后8、16周的腱-骨界面最大载荷值分别为假手术组的140.76%、146.53%。术后8、16周时,高、低剂量组与正常组、假手术组的腱-骨界面刚度值相比较,有显著统计学差异(P=0.000,P<0.05),高剂量组在术后8周时腱-骨界面的刚度值与低剂量组比较有显著意义(P=0.000,P<0.05),高剂量组术后16周腱-骨界面的刚度值分别是低剂量组的130.99%、141.90%。弹性模量值和位移在高剂量组的数值与低剂量组和假手术组比较,结果表明有显著统计学差异(P=0.000,P<0.05)。结果证实:高、低剂量组的最大载荷值随着术后时间的延长持续增高(各时间点之间进行比较,P<0.05)。高剂量组在术后8、16周时的最大载荷值明显增加,分别与同期的低剂量组和假手术组比较有显著差异(P<0.05),术后16周,最大载荷值在低剂量组的表达情况与假手术组比较,结果表明有显著差异(P<0.05)。结论:1.丝素蛋白生物补片在兔巨大肩袖断裂术后腱-骨修复过程中,采用实验就组织细胞学验证分析,腱-骨界面间的胶原纤维主要是通过增强Ⅲ型胶原蛋白的表达,进而在纤维结缔组织中能够形成四层特殊结构的类似直接止点并通过腱-骨界面被充分诱导和支持,最终形成促进腱-骨界面紧密连接和修复的组织。2.丝素蛋白生物补片显著提高愈合重建后的最大载荷值、刚度和位移生物力学指标,这种增高的机械拉力也加快了腱-骨界面的愈合以及重建。3.丝素蛋白生物补片有效加强了术后腱-骨界面的有序地致密连接,恢复生理功能,起到了一定的促进作用,有望成为修复巨大肩袖撕裂的良好载体。