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目的:比较胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂利拉鲁肽(Liraglutide)干预前后糖尿病大鼠心肌自噬标记分子LC3BmRNA表达及其蛋白含量,光镜下观察心肌脂肪沉积及纤维结构的改变,探讨GLP-1对糖尿病大鼠心肌自噬调节的机制。阻断自噬通路后,继续观察利拉鲁肽对糖尿病大鼠心肌脂质沉积及纤维结构的影响,进一步验证GLP-1是通过调节自噬而发挥对糖尿病心肌细胞的保护作用。方法:1、研究设计:应用高糖高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型,成模后予以利拉鲁肽干预4周,观察大鼠一般特征,检测内脏脂肪相对含量、血糖、血脂,测定自噬标志物LC3BmRNA表达及其蛋白含量,光镜下观察大鼠心肌脂肪沉积及纤维结构的改变,对自噬水平与脂质沉积程度进行相关性分析,并与未干预组相比较。应用氯喹抑制自噬体与溶酶体结合阻断自噬通路后,再比较各组大鼠一般特征、内脏脂肪含量、血糖、血脂、LC3BmRNA表达及其蛋白含量、心肌脂质沉积和纤维结构,并与对照组和未阻断组相比较。2、实验方法(1)糖尿病大鼠模型制备:36只4~5周龄的健康雄性Wistar大鼠,体重180~200g购于北京动物饲养中心,每笼6只,适应性喂养一周后,采用简单随机抽样法分为非造模组(10只)和造模组(26只)。对照组以基础饲料喂养,每克饲料提供热量13.4k J,其中脂肪占10.2%,蛋白质23.3%,碳水化合物66.5%;造模组以高糖高脂饲料喂养,每克饲料提供热量21.8k J,脂肪占56.0%,蛋白质7%,碳水化合物37.0%。早晚各喂养1次,自由饮水。饲养环境:光照12小时,室温18~22℃,相对湿度30%~70%。每2周测大鼠体重、空腹血糖(FBG)。12周时,非造模组大鼠FBG为4.4~4.9 mmol/L,造模组大鼠FBG为5.3~5.9mmol/L,隔夜禁食12h后,造模组大鼠按25mg/Kg腹腔注射链脲佐菌素溶液,非造模组大鼠腹腔注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72h后鼠尾采血测定两组大鼠FBG,以FBG≥7.8mmol/L并持续一周以上为糖尿病造模成功,其中造模组成模25只,死亡1只。非造模组大鼠FBG均在正常范围内。(2)大鼠分组及检测指标:非造模组大鼠设为正常对照组(NC组n=10),继续予基础饲料喂养。成模的25只糖尿病大鼠采用简单随机抽样法分为:糖尿病对照组(DMNS组,n=9)、利拉鲁肽干预组(LIR组,n=8)及利拉鲁肽+自噬抑制剂氯喹组(LIR+CQ组,n=8),三组继续予高糖高脂饲料喂养。LIR组以100ug/Kg每天两次腹部皮下注射利拉鲁肽溶液,LIR+CQ组以100ug/Kg每天两次腹部皮下注射利拉鲁肽溶液的同时以50mg/Kg每两天一次腹腔注射氯喹,DMNS组、NC组腹部注射等体积生理盐水。每周六测定各组大鼠体重及FBG。上述药物干预大鼠4周后,隔夜禁食12h,测定体重,鼠尾采血测定FBG、50%葡萄糖注射液灌胃(4ml/kg)测定餐后2小时血糖(2h BG)。次日空腹腹腔注射20%乌拉坦溶液(4ml/kg)麻醉大鼠,开腹后经腹主动脉取血,迅速离心后测定甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL-C)。采血后迅速分离心脏,PBS液冲洗后,切取三块约100mg的心脏组织,锡箔纸包裹放于冻存管,迅速投入液氮罐中保存,待行实时荧光定量PCR测定LC3BmRNA水平;取左心室部分组织浸泡于10%甲醛液,固定48h后石蜡包埋,备做病理切片,用于免疫组化测定LC3B蛋白的表达及光学显微镜下观察心脏脂肪沉积及心肌纤维情况。分离内脏脂肪(睾丸脂肪垫、双侧肾周脂肪、腹膜处及肠管间脂肪),称重,并计算内脏脂肪与体重的比值即内脏脂肪相对含量(VF/W)。(3)统计学方法:所有计量资料以均数±标准差表示,运用SPSS17.0统计软件分析,组间比较采用单因素方差分析(oneway-ANOVA)、LSD-t检验,两变量相关性采用Pearson相关分析,以P≤0.05为差异有统计学意义。结果:1.各组大鼠一般特征比较:适应性喂养期间,大鼠饮食量、体重无明显差异,精神状态良好,毛色光泽。造模期间,造模组大鼠较非造模组大鼠饮食量、体重均增加。造模成功后,药物干预期间,NC组大鼠饮食量较之前无变化,体重呈稳定增长,精神状态良好,毛色光泽;DMNS组大鼠较同期NC组大鼠体重增加,少动;LIR组大鼠较同期NC组大鼠饮食量及体重无差异,较同期DMNS组大鼠饮食量、体重均下降,精神状态好转;LIR+CQ组大鼠精神萎靡,体毛蓬松失去光泽,有脱毛现象,较同期NC组大鼠饮食量、体重增加,与同期DMNS组大鼠比较,饮食量、体重无差别。与NC组比较,DMNS组、LIR+CQ组大鼠内脏脂肪相对含量升高,差异有统计学意义(P<0.05),LIR组内脏脂肪相对含量差异无统计学意义(P>0.05)。与DMNS组比较,LIR+CQ组大鼠内脏脂肪相对含量差异无统计学意义(P>0.05),LIR组内脏脂肪相对含量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。2.各组大鼠生化指标比较:与NC组比较,DMNS组、LIR+CQ组大鼠FBG、2h BG、TG、TC、LDL-C升高,HDL降低,差异均有统计学意义(P<0.05);LIR组上述指标差异均无统计学意义(P>0.05)。与DMNS组比较,LIR组大鼠FBG、2h BG、TG、TC、LDL-C降低,HDL升高,差异均有统计学意义(P﹤0.05);LIR+CQ组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。与LIR组比较,LIR+CQ组FBG、2h BG、TG、TC、LDL-C升高,HDL降低,差异有统计学意义(P﹤0.05)3.各组大鼠心肌自噬水平及脂肪沉积比较:与NC组比较,DMNS组、LIR+CQ组大鼠LC3B蛋白及mRNA表达降低,泡沫细胞/总心肌细胞数比值升高,差异有统计学意义(P﹤0.05),LIR组大鼠LC3B蛋白及mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05),泡沫细胞/总心肌细胞数差异无统计学意义(P>0.05)。与DMNS组比较,LIR组大鼠LC3B蛋白及mRNA表达升高、泡沫细胞/总心肌细胞数下降,差异有统计学意义(P﹤0.05),LIR+CQ组大鼠LC3B蛋白及mRNA表达、泡沫细胞/总心肌细胞数差异无统计学意义(P>0.05)。4.心肌自噬水平与脂质沉积相关性分析:对泡沫细胞/总心肌细胞数比值与LC3BmRNA及其蛋白含量作Pearson相关性分析,结果提示心肌LC3BmRNA表达、LC3B蛋白含量与泡沫细胞/总心肌细胞数比值呈显著负相关(P﹤0.05)。5.各组大鼠心肌病理学比较:NC组大鼠心肌纤维排列整齐,细胞结构完整,染色均匀,细胞核呈圆形或椭圆形居中,未见泡沫细胞。DMNS组大鼠心肌满布泡沫细胞,细胞核被挤向细胞一侧,心肌纤维排列紊乱、断裂。LIR组大鼠心肌细胞结构恢复,细胞内未见明显核固缩、核溶解。LIR组与DMNS组比较,心肌泡沫细胞数量减少,心肌纤维排列较整齐;与NC组比较,心肌泡沫细胞数量增多,心肌纤维排列无明显变化。LIR+CQ组与NC组比较,心肌泡沫细胞数量增多,肌纤维断裂、排列紊乱;与DMNS组比较,心肌泡沫细胞数量及心肌纤维结构无明显差异。结论:1、糖尿病阶段存在心肌自噬减弱。2、GLP-1减轻糖尿病大鼠糖脂代谢紊乱。3、GLP-1通过增强自噬减轻糖尿病心肌脂质沉积和纤维结构紊乱。