猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）属于冠状病毒科（Coronaviridae）,α-冠状病毒属（Alphacoronavirus）,是一种危害养猪业的重大传染病病原。PEDV感染后导致猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）,主要引起猪严重的腹泻、呕吐和脱水,造成哺乳仔猪极高的死亡率。2010年以来,在亚洲、北美和欧洲的养猪场出现了高毒力的PEDV变异毒株,导致全球养猪业遭受巨大经济损失。被动乳汁免疫是保障新生哺乳仔猪免遭PED等肠道疾病影响的最有效方式。乳汁中高滴度的分泌型Ig A（secretory Ig A,sIgA）抗体有助于降低哺乳仔猪的发病率和死亡率。本研究制备了针对PEDV的单克隆抗体并利用多种手段进行鉴定,进一步基于单克隆抗体捕获病毒抗原的方式建立了针对乳汁中PEDV sIgA抗体的酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测方法。（1）PEDV单克隆抗体的制备本研究首先采用切向流超滤系统和凝胶过滤层析的方法纯化流行毒株PEDV CH/hubei/2016病毒粒子,将其作为免疫原免疫6～8周龄BALB/c小鼠。取血清抗体效价较高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。通过免疫过氧化物酶单层细胞试验（immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）筛选融合后的杂交瘤细胞株,并对阳性细胞株进行连续亚克隆。本研究共获得10株稳定分泌PEDV特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。（2）PEDV单克隆抗体的鉴定本研究构建PEDV结构蛋白表达载体并进行重组表达,利用PEDV重组蛋白对单克隆抗体进行ELISA和免疫印迹试验（Western-blot）鉴定。经间接免疫荧光试验（immunofluorescence assay,IFA）和激光共聚焦扫描显微术（confocal laser scanning microscopy,CLSM）进一步验证单克隆抗体与病毒的反应性。结果显示,共获得4株PEDV纤突糖蛋白（spike protein,S）单克隆抗体和6株PEDV核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,N）单克隆抗体。通过小鼠体内诱生法制备腹水,抗体的IPMA效价在2.56×10-4至1.024×10-5之间。IFA结果表明4株单克隆抗体可特异性识别PEDV感染的非洲绿猴肾上皮Vero细胞。CLSM发现,针对S蛋白的单克隆抗体可以指示PEDV感染Vero细胞过程中病毒新合成S蛋白的亚细胞定位。（3）PEDV sIgA抗体ELISA检测方法的建立本研究以单克隆抗体捕获病毒抗原的方式,建立检测猪临床乳汁样本中PEDV sIgA抗体ELISA方法。重复性试验结果显示该方法变异系数在4.0%～8.1%之间,重复性较好。临床阳性乳汁样品稀释1280倍,ELISA仍可检测出阳性,敏感性较高。使用本试验方法与商品化试剂盒共同检测临床样品,结果显示具有较高的一致性。综上所述,本研究成功制备了10株PEDV特异性单克隆抗体,并利用多种手段对单克隆抗体进行鉴定,为后续PEDV感染机制和临床检测提供了重要的分子基础。本研究进一步基于单克隆抗体捕获病毒抗原方式建立了PEDV sIgA抗体ELISA检测方法,为PEDV疫苗免疫评估提供了有力工具。