背景：乳腺癌在女性恶性肿瘤中最为常见,其发病率呈逐年上升趋势,为女性癌症死亡原因的第二位,严重威胁女性的生命健康和生活质量。在这些患者中,约25%～30%的乳腺癌患者伴有HER-2的过度表达,她们往往表现为易发生淋巴结转移,对内分泌治疗相对耐药,化疗缓解期缩短,预后比HER-2阴性患者差。曲妥珠单抗(赫赛汀,Herceptin)是一种人源化的针对人表皮生长因子受体-2(HER-2)膜外部分的单克隆抗体,它显著改善了HER-2阳性患者的治疗效果,但并不是所有HER-2阳性的患者应用曲妥珠单抗均有效。在HER-2阳性乳腺癌患者的新辅助、辅助、姑息治疗阶段均可能出现分子靶向药物治疗耐药的现象。因此,寻找有效的曲妥珠单抗治疗HER-2阳性乳腺癌疗效预测指标具有重要意义。TIP30/CC3(Tat-interactive protein30),是上世纪末Shtivelman等研究人员应用RNA差异显示技术发现它高表达于转移性低的小细胞肺癌细胞系,相反在转移性高的小细胞肺癌细胞系它多为阴性表达,据此人们推测其与肿瘤转移抑制相关。随后发现TIP30/CC3可以通过HIV (human immunodeficiency virus)转录辅助因子Tat蛋白的结合来调控Tat蛋白的转录功能,使HIV的增殖能力提高,所以也称HITAP2(HIV-1Tatinteraetive protein2)。近年来国内外多项研究发现它在肺癌、胃癌、肝癌及肠癌等多种癌组织中表现为低表达甚至缺失。敲除TIP30基因的小鼠可以自发性形成肝癌、膀胱癌及乳腺癌等多种肿瘤。这些均提示TIP30是一种抑癌基因。研究发现TIP30抑制肿瘤发生与发展的机制包括减慢肿瘤细胞的生长速度、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤新生血管形成、调控DNA的损伤及修复、增加肿瘤细胞对化疗的敏感性等。文献报道在乳腺癌细胞中,TIP30可以与Tat蛋白、RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase II)一起共同刺激HIV-1,并且活化Tat蛋白的转录,共同参与多种细胞信号传导通路,调节抑癌基因P53的转录和抑制ERa调节的c-myc等基因的转录。在对乳腺癌患者进行TIP30表达与临床预后的关系研究中,多数结果显示TIP30表达水平与脉管侵犯和腋窝淋巴结转移为负相关,认为TIP30表达下调提示乳腺癌患者预后不良。部分实验发现TIP30基因表达与HER-2表达呈正相关的关系,且TIP30基因和c-erbB-2基因参与调节细胞增殖和分化的MAPK通路和PI3K/AKT通路的信号级联放大功能。这些提示我们TIP30在乳腺癌的发生、发展中起重要作用,可能与乳腺癌的分子分型有关。EGFR (epidermal growth factor Receptor)是原癌基因c-erbB1的表达产物,与HER-2同为表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。EGFHR在肺癌、肠癌等多种实体肿瘤中都存在高表达或异常表达情况,它可以与EGF等配体结合,激活下游的信号传导通路(?)BPI3K/AKT、MAPK/ERK等,调控肿瘤细胞的生长、分化、黏附和浸润转移等多个过程。在对曲妥珠单抗耐药的研究中,有学者发现曲妥珠单抗联合EGFR的酪氨酸激酶抑制剂,如吉非替尼(gefitinib)或埃罗替尼(erlotinib),可使耐药细胞株生长受到抑制,提示EGFR表达上调与曲妥珠单抗耐药有关。在肝癌和肺癌的研究中,肖华等发现TIP30可以通过调控EGFR细胞浆内转运,下调EGFR下游信号通路的活性,抑制肿瘤发生、发展。目前TIP30与EGFR在HER-2过表达晚期乳腺癌中的相关性研究尚无报道,TIP30在乳腺癌发生、发展中的作用机制尚未清楚,它是否也通过影响EGFR表达及其信号传导来发挥其生物学作用,这些都有待我们进一步研究证实。目的：1、观察TIP30在HER-2过度表达乳腺癌组织和HER-2阴性乳腺癌组织中蛋白表达的差异。2、分析TIP30与HER-2过度表达乳腺癌患者临床病理特征(年龄、ECOG PS评分、病理类型、转移部位数、ER/PR表达情况)、生物化疗近期疗效(无进展生存期,PFS)之间的关系。3、分析EGFR与HER-2过度表达乳腺癌患者临床病理特征(年龄、ECOG PS评分、病理类型、转移部位数、ER/PR表达情况)、生物化疗近期疗效(无进展生存期,PFS)之间的关系。4、分析HER-2过表达乳腺癌中TIP30与EGFR的相关性。实验材料和方法：1.实验材料1.1研究对象筛选2006年10月至2009年11月南方医科大学附属南方医院诊治并符合本研究条件的乳腺癌患者病理组织共53例,具备以下条件：(1)南方医院术后病理诊断为原发性浸润性乳腺癌；(2)HER-2免疫组化检测+++或FISH检测阳性；(3)有完整的临床资料；(4)有可测量病灶；(5)生物化疗前未接受放疗和化疗；(6)接受生物化疗(曲妥珠单抗联合紫杉醇)至少2个周期。另取49例HER-2阴性乳腺癌组织作为对照。1.2实验试剂兔抗人的TIP30多克隆抗体,兔抗人的EGFR单克隆抗体,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗,苏木素,DAB显色剂,1%盐酸乙醇,95%乙醇,无水乙醇等。2.实验方法2.1TIP30蛋白在乳腺癌组织中表达的检测采用免疫组织化学法检测53例HER-2过表达乳腺癌和49例对照组HER-2阴性乳腺癌石蜡切片中TIP30表达情况。石蜡组织切片,脱蜡水合、用抗原修复、血清封闭后滤干,添加TIP30抗体(稀释浓度1：50),4℃过夜后,复温45min用PBS冲洗,再加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗,室温下孵育1h后,DAB显色,苏木素复染2min,水洗,脱水,中性树胶封片,镜下观察。采用半定量双盲法评分,Olympus光学显微镜高倍镜(400倍)下每张切片随机选取5个视野,分别计数至少200个细胞。TIP30是以细胞质出现棕色颗粒为阳性染色。染色结果用镜下观察的细胞显色程度及显色比例两项分值乘积统计。细胞显色程度：无显色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分,细胞显色比例：<10%为0分,10%～30%为1分,31%～60%为2分,>60%为3分。两项分值乘积>2分者判定为表达阳性,≤2分者为阴性表达。2.2TIP30和EGFR蛋白在HER-2过度表达乳腺癌组织中表达的检测采用免疫组织化学法检测53例HER-2过表达乳腺癌石蜡切片中TIP30和EGFR表达情况。石蜡组织切片,脱蜡水合、抗原修复后滤干,添加TIP30抗体或EGFR抗体(稀释浓度1：50),4℃过夜,复温45min, PBS冲洗,加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗,室温下孵育1h后,DAB显色,苏木素复染2min,水洗,脱水,中性树胶封片。采用半定量双盲法评分,显微镜高倍镜(400倍)下每张切片随机选取5个视野,计数至少200个细胞。TIP30以细胞质出现棕色颗粒为阳性染色。EGFR以细胞膜上出现褐色颗粒为阳性染色。染色结果用细胞显色程度及显色比例两项分值乘积统计,方法同2.1中TIP30免疫组织化学法检测。2.3TIP30和EGFR蛋白表达与HER-2过表达晚期乳腺癌患者临床病理特征及预后之间的关系收集53例HER-2过表达晚期乳腺癌病人的临床资料,按照患者的年龄(≥50、<50岁)、病理类型(浸润性导管癌、其他类型)、ECOG PS评分(<2分、=2分)、转移部位数(<2、≥2)、ER(阴性、阳性)、PR(阴性、阳性)情况对TIP30和EGFR进行分层分析。同时结合患者影像学资料,按2009年1.1版RECIST标准计算患者的无进展生存期(PFS),并对TIP30进行单因素和多因素生存分析,评价TIP30是否可以作为HER-2过表达晚期乳腺癌病人的生物化疗(曲妥珠单抗联合紫杉醇)疗效的预测指标。2.4TIP30与EGFR在HER-2过表达晚期乳腺癌中的相关关系采用免疫组织化学染色法检测TIP30与EGFR两种蛋白在HER-2过表达乳腺癌组织切片中表达情况的差异,并初步探讨两种蛋白表达之间的关系。3数据分析采用SPSS16.0统计软件分析。TIP30在HER-2过表达晚期乳腺癌和HER-2阴性乳腺癌之间的表达差异采用Pearson χ2检验；TIP30及EGFR两者与患者临床病理参数之间的比较亦采用Pearsonχ2检验；采用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析,采用Cox风险比例回归模型法进行多因素生存分析,P<0.05为差异具有统计学意义。TIP30和EGFR相关性采用Spearmar湘关分析。结果：1、TIP30在HER-2过度表达乳腺癌组织和HER-2阴性乳腺癌组织中表达情况53例HER-2过表达晚期乳腺癌组织中,30例TIP30表达阳性,阳性表达率为56.6%。而49例HER-2阴性乳腺癌患者组织中,22例TIP30表达阳性,阳性率为44.9%,低于HER-2过表达晚期乳腺癌组织(P=0.237),但差异无统计学意义。2、TIP30和EGFR两种蛋白表达与HER-2过表达晚期乳腺癌患者临床病理特征的关系TIP30蛋白表达与患者年龄、病理类型、转移部位数以及ER、PR表达状态无关,而与ECOG PS(P=0.003)显著相关。EGFR蛋白表达则与患者年龄、ECOGPS、病理类型、转移部位数以及ER、PR表达状态均无相关性。3、患者临床病理特征与HER-2过表达晚期乳腺癌患者生物化疗疗效的关系对53名患者采用RECIST Version1.1进行生物化疗的疗效评估。研究结果表明,患者的无进展生存期(Progression-free Survival, PFS)与其年龄、病理类型、转移部位数、EGFR以及ER、PR表达状态没有显著的相关性。但在患者基线特征与PFS相关性的单因素分析中,发现除患者ECOG PS评分情况与PFS显著相关(P=0.001)外,TIP30表达情况与患者PFS也具有显著相关性。在TIP30阳性表达的患者,临床获益率为73.3%,显著高于TIP30阴性表达的患者(30.4%),差异有统计学意义(χ2=9.669,P=0.02)。TIP30表达阳性组的中位无进展生存期(Progression-free Survival, PFS)较阴性组显著延长(11.47个月vs4.87个月),差异有统计学意义(P<0.001)。多因素分析则表明TIP30是HER-2过表达乳腺癌患者PFS的独立预测因素(RR:6.414;95%CI:2.317-17.758; P<0.001)。4、TIP30和EGFR两种蛋白在HER-2过表达晚期乳腺癌组织中的表达相关性53例HER-2过表达晚期乳腺癌组织中,TIP30的阳性率为56.6%(30/53),而EGFR在HER-2过表达晚期乳腺癌中的表达阳性率26.4%(14/53)。采用Spearman相关性分析,TIP30与EGFR蛋白在HER-2过表达晚期乳腺癌组织中表达相关系数为-0.339,P=0.013(P<0.05),表明两者存在着负相关。结论：1.TIP30在HER-2过度表达乳腺癌组织和HER-2阴性乳腺癌组织中表达无显著差异。2.TIP30在HER-2过表达晚期乳腺癌组织中表达与ECOG PS相关,与患者年龄、病理类型、转移部位数以及ER、PR表达状态无关。3.生物化疗后,TIP30表达阳性患者的临床获益率、中位无进展生存期(Progression-free Survival, PFS)较阴性组有显著优势。提示TIP30蛋白在HER-2过表达晚期乳腺癌组织中表达上调,可能是曲妥珠单抗联合化疗的HER-2过表达乳腺癌患者生物化疗疗效好的预测指标之一。4.TIP30与EGFR在HER-2过表达晚期乳腺癌中的表达呈负相关,提示在HER-2过表达晚期乳腺癌中TIP30蛋白表达可能与EGFR信号传导通路的调控有一定的相关性。