目的:本实验室前期试验显示，在大鼠脑缺血模型的缺血／复灌过程中伴随着nNOS的Ser847磷酸化水平的改变其巯基亚硝基化水平也发生一系列变化，但是其机制及意义尚不明确。本实验拟在细胞系HEK293中过表达nNOS野生型质粒及突变体质粒并给予外源性一氧化氮供体，以验证其能发生亚硝基化并鉴定其亚硝基化位点。同时在原代皮质神经元中建立缺糖缺氧／复氧(OGD/reoxygenation)模型，以阐明nNOS去亚硝基化机制。另外在大鼠脑缺血模型中及培养原代皮质细胞给予药物MK801、GSNO、DTT和Trx/TrxR系统抑制剂金诺芬(auranofin)和DNCB以及钙调蛋白(CaM)抑制剂W-7等观察nNOS磷酸化水平、亚硝基化水平及nNOS与CaM结合情况的变化，以阐明nNOS在缺血／复灌过程中发生去亚硝基化的意义及其分子机制。　　 方法:采用大鼠四动脉结扎全脑缺血模型，焦油紫染色观察神经元细胞损伤情况，免疫组化、免疫印记及TUNEL等观察nNOS磷酸化和亚硝基化改变以及其去亚硝基化在脑缺血损伤中的作用。培养HEK293细胞并利用脂质体转染法过表达nNOS野生型质粒及突变体质粒并给予外源性一氧化氮供体，生物素转化法检测过表达目的蛋白的亚硝基化程度并鉴定亚硝基化位点。原代皮质神经元体外培养进行OGD/reoxygenation，施加NMDA受体拮抗剂MK801、GSNO和DTT及金诺芬、DNCB和W-7等，进一步阐明nNOS发生去亚硝基化的分子机制及意义，并通过DAPI染色检测神经元凋亡。　　 结果:1．在HEK293细胞中，生理性～氧化氮供体GSNO可以使过表达的nNOS能发生亚硝基化，巯基烷化剂NEM及还原剂DTT可以抑制或逆转这种反应，钙载体A23187可以使nNOS去亚硝基化。2.Cys331位半胱氨酸为nNOS亚硝基化主要位点。3．原代皮质细胞中nNOS在静息状态下处于一定的亚硝基化水平，在OGD/reoxygenation6h时nNOS发生去亚硝基化，同时其磷酸化水平降低。而给予NMDA受体的拮抗剂MK801或生理性NO供体GSNO后再进行OGD/reoxygenation则可以抑制nNOS发生去亚硝基化及去磷酸化。而在给予GSNO的基础上再给还原剂DTT则可减低GSNO对nNOS的上述作用。4.OGD/reoxygenation诱导的nNOS去亚硝基化和去磷酸化可以被预给药Trx/TrxR系统的抑制剂金诺芬和DNCB抑制。同样，预给药钙离子螯合剂EGTA及BAPTA或钙调蛋白拮抗剂W-7也可以抑制OGD/reoxygenation诱导的nNOS去亚硝基化和去磷酸化。5.DAPI染色结果显示OGD/reoxygenation后神经元细胞大量凋亡，而给药MK801、GSNO两组神经元细胞凋亡数量明显减少，DTT可以抑制GSNO对神经元细胞的保护作用。预给药aoranofin、DNCB、EGTA、BAPTA及W-7均对OGD/reoxygenation处理后的神经元有保护作用。6.整体动物实验进一步验证了原代细胞水平的实验结果。7．免疫组化结果进一步证实nNOS磷酸化水平的变化。8．焦油紫染色的结果表明，在缺血／再灌后神经元损伤严重，而给药MK801或GSNO后神经元损伤明显减轻，而DTT则可逆转GSNO对神经元的保护作用。9.TUNEL凋亡检测结果进一步证实了焦油紫染色的结果。　　 结论:nNOS活性受蛋白质亚硝基化调节，其可以被内源性及外源性NO供体亚硝基化。nNOS的亚硝基化位点是Cys331。缺血／复灌或OGD/reoxygenation可诱导神经元中nNOS发生去亚硝基化而使酶激活。nNOS去亚硝基化过程与NMDA受体介导的Ca2+内流有关且具有Ca2+/CaM依赖性。nNOS去亚硝基化过程主要由Trx/TrxR系统介导。缺血／复灌或OGD/reoxygenation过程中抑制nNOS去亚硝基化可降低神经元的损伤。