目的:　　 HIV-1感染机体后可以诱导产生体液免疫和细胞免疫。已有研究表明,利用HIV-1单克隆抗体(Mabs)被动免疫恒河猴后可以保护其免受致病性SHIV的攻击,提示中和抗体在HIV-1感染过程中可能具有保护作用。然而,对于不同疾病进展阶段HIV-1感染者中和抗体水平的研究结论并不一致。一些研究表明,HIV-1感染者体内含有不同水平针对自体病毒、异体病毒和实验室毒株的中和抗体,与疾病进展者相比,缓慢进展者(slow progressor,SP)体内含有较高水平针对自体病毒、异体病毒和实验室毒株的中和抗体;针对自体病毒和异体病毒的中和抗体可以有效控制母婴垂直传播。以上均证明了中和抗体在控制HIV-1感染者疾病进展中发挥着重要的作用。而另一些研究表明,SP体内没有或含有较低水平针对自体和异体病毒的中和抗体,缓慢进展者和疾病进展者中和抗体水平没有显著性差异。在不同亚型HIV-1感染者之间,中和抗体的保护作用也存在差异。与B亚型HIV-1感染者相比,来自非洲地区的C亚型HIV-1感染者血浆具有较强中和原代病毒的能力。因此,关于不同亚型HIV-1感染者针对自体和异体病毒中和抗体与疾病进展的关系还有待进一步研究。　　 明确不同疾病进展阶段HIV-1感染者针对自体病毒和异体病毒的中和抗体水平以及是否存在具有广泛交叉中和作用抗体,将为HIV-1疫苗的设计提供理论依据。对于B和C亚型HIV-1感染者研究表明,大约有10％的HIV-1感染者体内含有具有广泛交叉作用的中和抗体,目前已从这些感染者体内分离到多种具有广泛交叉作用的Mabs,如IgG1b12、2G12、447-52D、2F5、4E10,它们对多种原代病毒具有中和作用。因此,这些感染者成为研制有效疫苗的研究热点。　　 中国B/C亚型HIV-1感染者占总感染人数的47％,多以吸毒途径感染,且存在由高危人群向一般人群扩散的趋势,是中国HIV-1的主要流行株之一。上述有关中和抗体的研究主要来自于欧美及非洲B和C亚型HIV-1感染者,且结果不尽相同。由于中国人免疫特点不同于欧美及非洲人群,对于中国B/C亚型HIV-1感染者不同疾病进展阶段中和抗体水平少有报道,而对于广泛交叉作用中和抗体的研究尚属空白。　　 本研究利用本实验室分离的自体和异体原代分离株,采用外周血单个核细胞(PBMC)中和抗体实验,测定中国B/C亚型HIV-1感染者血浆对自体病毒、异体病毒的中和作用,筛选具有广泛交叉作用的中和抗体,探讨中国BYC亚型HIV-1感染者中和抗体水平以及中和抗体水平与疾病进展的关系,为我国临床抗HIV治疗、疫苗设计提供科学依据。　　 方法:　　 1、实验对象　　 研究对象来自云南、新疆、辽宁地区,其HIV-1感染由中国医科大学附属一院艾滋病确认实验室根据《中华人民共和国HIV/AIDS诊断标准》用WB试验确认为阳性。样品采集时间为2004年6月-2006年9月。用加有15％乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂的真空采血管抽取静脉血10 ml,全血用于病毒分离,离心分离血浆-80℃冻存。　　 MT2细胞系、GHOST-CCR5及GHOST-CXCR4细胞系由中国CDC惠赠。　　 2、CD4绝对值计数　　 将20μl CD4/CD8/CD3 TriTEST试剂加入CD4绝对计数管中,加入50μl抗凝血,室温避光15min,加入免洗溶血素450μl,室温避光15min,FACS MEILTISET软件检测并进行自动分析,计算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞绝对值及相应比值。　　 3、病毒载量测定　　 采用RT-PCR方法,按照罗氏公司HIV病毒载量测定说明书进行操作。病毒载量的最低检出线为400 copies/ml。HIV-1感染者的病毒载量转化为以10为底的对数用于统计学分析。　　 4、病毒分离　　 采用微量全血法。用密度梯度离心法分离健康人PBMC,以含2.0μg/ml植物血凝素(PHA)的RPMI-1640(美国GIBCO公司)预刺激培养72h。在病毒分离24h前,将PBMC用20 U/ml IL-2(美国罗氏公司)活化,于24孔板中备板。每孔加2ml含PBMC(浓度为1×106cells/ml)的1640(含10％胎牛血浆,1％L2-谷氨酰胺,2μg/ml聚凝胺,1％青-链霉素和20U/ml的IL-2)。将HIV-1感染者抗凝全血在24孔板上做25μl、50μl、100μl三个梯度稀释,37℃,5％CO2培养。每3天换液,每7天加入新鲜预刺激72h的健康人PBMC。1周后,每3天测一次P24,直至30天。P24阳性的上清收集冻存于-80℃冰箱中备用。　　 5、TCID50检测　　 将PHA预刺激的健康人PBMC经20U/ml IL-2活化后,调整浓度为4×106cells/ml。96孔板中每孔加入PBMC悬液50μl。每孔加入经4倍稀释至4-8的病毒悬液50μl,37℃5％CO2培养。第3天换液,第7天测p24。以Spearman-Karber方法计算TCID50。　　 6、SI/NSI表型测定　　 利用MT-2细胞系进行合胞体诱导形成检测。将MT-2细胞按2×105 cells/300μl/孔加入到48孔板上。用含100 TCID50病毒上清染毒,37℃,5％CO2培养14天。每2～3天倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)情况。以实验室毒株SF33为阳性对照,Ba1为阴性对照。　　 7、辅助受体利用实验　　 将GHOST细胞接种24孔板,每孔6×104 cells/0.5ml。第2天,细胞单层约70％分布,去掉培养基。取100 TCID50病毒悬液进行染毒,37℃、5％CO2孵育2 h后,用PBS洗涤三遍,用2ml培养液重悬细胞进行培养。同时采用SF33和BaL-2作为阳性和阴性对照。3天后收获病毒上清测定p24。　　 8、亚型测定　　 全血提取核酸,采用PCR对gag、pol区基因片断进行扩增。反应产物经提纯后,在美国ABI公司的377型DNA全自动测序仪上进行序列测定和分析。测得的序列用Bioedit软件进行编辑校正后,使用Wisconsin PackageGCG(Version10)软件进行分析。以Pileup程序对样品及国际标准序列进行排列和比较,其中国际标准参考序列从美国Los Alamos核酸序列库网站下载,用Mega软件的Neighbor-joining法绘制系统进化树。　　 9、中和抗体实验　　 56℃,30分钟灭活HIV-1感染者和正常人血浆(NHP)。用正常人血浆对HIV-1感染者血浆进行倍比稀释,2倍稀释6次(从1/10～1/320),每个稀释度的血浆量是25μL。把稀释后的血浆加入96孔板(3个平行孔)。在每孔中加入25μl含100TCID50病毒稀释液,把培养板放入37℃孵育30min。加入50μl用1640培养液(含10％FBS、2％PS、1％L-glulamin)悬浮的PHA预刺激3天健康人PBMC,按每孔5×105 cells加入培养板中,培养16-18h,洗涤细胞3次,用200μl培养液重悬细胞,培养第4天换液,第7天测p24。以正常人血浆加病毒悬液为对照孔。以抑制50％阴性孔p24浓度的血浆最高稀释倍数的倒数计算中和抗体滴度。中和抗体滴度≥1:10为具有中和作用;中和抗体滴度＜1:10无中和作用。　　 10、筛选广泛交叉作用中和抗体(BCN)　　 选择基因同源性较低的3株原代病毒用于广泛交叉中和抗体的筛选。用正常人血浆对HIV-1感染者血浆进行1:10倍稀释。中和抗体试验方法和判定标准同方法9。能够同时对3个病毒发挥中和作用的HIV-1感染者定义为具有广泛交叉作用抗体(BCN);对3个病毒均不发挥中和作用的HIV-1感染者定义为非广泛交叉作用抗体(Non-BCN)。将某个HIV-1感染者血浆能够中和异体病毒的个数占3个异体病毒的百分率定义为HIV-1感染者中和异体病毒的宽度;将某个HIV-1感染者血浆中和3个异体病毒抗体滴度的几何平均滴度定义为HIV-1感染者中和异体病毒的强度。　　 11、广泛交叉作用中和抗体(BCN)滴度测定　　 经筛选,可同时中和3株HIV-1的18例血浆用于BCN中和抗体滴度测定。利用JL125、LN82、HA19、JL66、YN08、YN103、YN108、SF33、BaL等9个HIV-1(包括7个原代病毒和2个实验室毒株)对18例BCN HIV-1感染者血浆进行中和抗体水平检测,中和抗体实验同方法9。随机选择8例Non-BCN HIV-1感染者血浆进行中和抗体滴度的测定。　　 12、统计学分析　　 所有统计均采用SPSS15.0软件非参数检验。不同疾病进展阶段患者之间中和抗体水平的差异用Mann-Whitney U检验;中和抗体与病毒载量的相关性分析采用Spearman检验。BCN与Non-BCN血浆对同一原代病毒中和抗体水平的比较采用Wilcoxon检验;不同疾病进展阶段中和抗体发挥作用数量的比较采用x2检验。　　 结果:　　 1、不同时期血浆针对自体病毒中和作用与疾病进展的关系　　 我们将从血液标本中分离到的病毒设为V,病毒分离时采集的血浆标本设为P0:6个月后采集的血浆设为P6。在P0-V的中和抗体实验中,从SP组分离到的原代分离株中,100％(3/3)可被P0中和作用,而HIV组中仅有19.04％(4/21)的原代分离株可被P0中和作用,中和抗体滴度与病毒载量无明显相关性(P=0.110)。在P6-V的中和抗体试验中,能够被P0中和的7株原代分离株(SP组3株,HIV组4株)中和抗体水平明显增高,HIV组中不能被P0中和的17株原代分离株中,有8株可以被P6中和,中和抗体滴度与病毒载量呈显著的负相关(r=-0.54,P=0.001)。在P0-V和P6-V中和抗体试验中,SP组中和抗体滴度显著高于HIV组(P=0.007,0.021)。　　 2、不同疾病进展阶段针对异体病毒中和抗体与疾病进展的关系　　 结果显示,HIV-1慢性感染组与AIDS组之间中和异体病毒的宽度和强度存在显著性差异,HIV-1慢性感染组显著高于AIDS组(P=0.011)。HIV-1慢性感染组中和异体病毒的宽度和强度与病毒载量呈正相关(r=0.400,P=0.002),而AIDS组中和异体病毒的宽度和强度与病毒载量没有显著的相关性。HIV-1慢性感染组和AIDS组中和异体病毒的宽度和强度与CD4T淋巴细胞数均没有显著的相关性(P=0.423,0.701)。　　 3、广泛交叉中和抗体(BCN)的筛选和滴度测定　　 117例B/C亚型HIV-1感染者中,有15.4％(18/117)的HIV-1感染者可以中和所有的3株原代病毒,有74.4％(87/117)的HIV-1感染者至少可以中和1株以上的病毒。我们根据有无AIDS指征性疾病和CD4T淋巴细胞数将HIV-1感染者分为HIV慢性感染组和AIDS组,在BCN存在的数量上,HIV慢性感染组组明显高于AIDS组(P=0.046)。　　 18例BCN HIV-1感染者中,有13例HIV-1感染者可以同时中和9株HIV-1,其余5例可以中和8株HIV-1。随机抽取的8例Non-BCN HIV-1感染者中,只能中和7株HIV-1原代病毒中的1-2株,所有Non-BCN对实验室毒株(SF33、BaL)均具有中和作用。BCN(n=18)与Non-BCN(n=8)HIV-1感染者对9株HIV-1(包括原代毒株和实验室毒株)在中和抗体滴度和中和病毒数量上均存在显著性差异(P=0.008)。　　 结论:　　 1、中国B/C亚型HIV-1感染者缓慢进展者组均含有较高水平针对自体病毒的中和抗体,6个月后中和抗体水平明显增高,HIV组感染者体内无或有较低水平针对自体病毒的中和抗体,6个月后中和抗体水平仅部分增高,提示针对自体病毒的中和抗体与疾病进展相关;针对自体病毒的中和抗体滴度与病毒载量呈负相关,提示中和抗体可能在控制HIV-1复制方面起重要作用。　　 2、中国B/C亚型HIV-1感染者不同疾病进展阶段针对异体病毒中和作用能力不同,HIV慢性感染组显著高于AIDS组,当疾病进展到AIDS期时,失去对异体病毒的中和作用,提示针对异体病毒的中和抗体与疾病进程有关,HIV慢性感染组针对异体病毒的宽度和强度与病毒载量正相关,提示病毒复制可能驱动针对异体病毒中和抗体的产生。　　 3、中国B/C亚型HIV-1感染者中存在具有较高水平的广泛交叉作用的中和抗体。利用同源性低的代表性HIV-1可以有效筛选出具有广泛交叉作用的中和抗体,它们之间可能存在共享的中和表位。