研究背景和目的:　　癫痫(Epilepsy)是以脑部神经元异常放电为特征的慢性脑功能障碍临床综合征，其中约30％为难治性。生酮饮食(Ketogenic diet，KD)作为有效的治疗方案应用于难治性癫痫的治疗已近一个世纪之久。临床研究发现KD不仅有益于儿童的多种癫痫综合征的治疗，而且对成人和青少年的癫痫类型亦有显著疗效。KD是一种高脂肪、适量蛋白、低碳水化合物的饮食方案。目前KD在治疗难治性癫痫方面的疗效被大部分学者认同，成为治疗难治性癫痫的安全有效的治疗手段，对多种癫痫和癫痫综合征有效。　　动物实验是研究KD机制的重要手段。戊四唑（Pentylenetetrazol，PTZ）是目前全身性给药当中应用最广泛的致惊药物，是诱发全面性强直阵挛发作(generalized tonic-clonic seizures，GTCS)最为常见的药物之一。啮齿类动物被注入PTZ溶液后可诱发全面性的痫性发作，从而被广泛地用来评价抗癫痫药物（anti-epilepsy drugs，AEDs）的疗效。PTZ溶液可经皮下、腹腔或静脉途径进入动物体内，PTZ尾静脉注射诱导急性致痫模型有利于测定KD对各种类型癫痫发作阈值的作用。然而既往急性致痫模型文献往往仅注重KD对临床发作阈值的作用，缺乏KD对脑内痫性放电阈值影响的相关资料。慢性点燃模型能很好地模拟人类复杂部分性及继发全面性癫痫，并用于研究点燃建立过程中的不同痫性发作状态的变化，在研究癫痫的发生过程中有其它模型无法比拟的优势，通常分为电点燃和化学点燃模型。PTZ亚惊厥剂量重复注射法是目前较为经典的慢性化学点燃癫痫动物模型，与人的失神性发作（小发作）、肌颤性、阵挛性和GTCS相似，可用来研究多种类型癫痫的形成和发作过程的机制研究。既往我们课题组已经研究了KD对杏仁核慢性电点燃癫痫模型的作用。因此在本实验中我们采用了两种癫痫模型来研究KD在PTZ急性和慢性癫痫过程中的作用，希望能提供更好的科学价值。　　虽然大量的临床和动物实验已充分证实KD具有抗惊厥作用，但其作用机制尚不完全清楚，进一步验证KD的机制，也能为今后其它的治疗手段提供参考。近年来不断有研究表明，γ-氨基丁酸A型受体(gamma-aminobutyric acidA receptor,GABAA)功能的转化（由抑制性向兴奋性）可能是癫痫发病机制的重要环节之一。细胞膜上氯离子转运体和氯离子浓度决定GABAA受体的兴奋性。钾-氯离子共转运体2(K-CI-cotransporter, KCC2)和钠-钾-氯离子共转运体1(Na+-K+-2CI-cotransporter, NKCCl)是阳离子-氯离子协同转运体的两种主要成分，控制神经元质膜上氯离子的电化学梯度，驱使氯离子的出胞和入胞。体外研究表明KD可能修饰阳离子-氯离子协同转运体，从而调节GABAA受体的兴奋性。为了解KD抑制癫痫的作用机制，我们探索了在PTZ慢性点燃过程中KD对皮质KCC2和NKCC1的蛋白表达调控作用。　　研究方法:　　1.P28天SD大鼠按体重配对后分入KD组及ND组，喂食Ketocal及正常食物各4周，每隔2天测定体重。P56天手术，4颗不锈钢自攻螺丝植入皮层，双股螺旋不锈钢双极电极植入右侧腹侧海马，术后休息10天，进入阈值测定程序。　　2.两组大鼠测定电临床阈值(electroclinical thresholds)。通过输液泵以恒定速度6.0ml/h输入新鲜配置的PTZ溶液(20mg/ml)进入大鼠尾静脉，诱发出一系列脑电临床癫痫发作。将每个观察指标所需的输液时间统一换算为PTZ痫性发作所需的阈值剂量（mg/kg）。　　3.PTZ慢性化学点燃程序。P28天SD大鼠按体重配对后分入KD组和ND组，喂食Ketocal及正常饮食4周，P56天进入化学点燃程序，期间饮食治疗不间断。新鲜配置的PTZ溶液按亚惊厥剂量(35mg/kg)隔日分别给两组大鼠腹腔注射，共13次，直至呈完全点燃状态。每次注射后观察30min，记录行为，根据Racine分级判定给药后发作等级、肌阵挛潜伏期、阵挛潜伏期等参数。　　4.通过Western blot方法半定量检测两组大鼠皮质不同饮食喂养四周后，即未开始点燃前(Pre-kindling)和点燃发作的各个状态（明显肌阵挛发作、GTCS）KCC2和NKCC1的蛋白表达变化。　　结果:　　1.两组大鼠喂养过程中体重均增加，但KD组大鼠体重明显低于ND组。KD组大鼠除了皮毛油性多、脱毛外，其它生物学及行为学特征上和ND组比较并无显著区别。　　2.PTZ诱导癫痫电临床发作阈值:生酮饮食并不改变整个发作进程，随着尾静脉输注PTZ溶液的累加，两组大鼠行为学和EEG上均出现一系列相似的变化。在脑电图上(EEG)上依次观察:首个孤立的尖波(first spike);首个棘波放电(first spike-and-wave discharge，SWD);亚持续状态的棘波爆发（subcontinuousspike-and-wave discharges，subcontinuous SWD），且在20秒观察时间内，放电时间至少超过50％;随后出现高波幅的棘波（high amplitude spike-and-waveactivity），此时大鼠多出现单双肢强度不同的阵挛发作;当出现多棘波(polyspikedischarges)时，大鼠出现剧烈的GTCS。在临床发作上连续观察:愣神样发作;首个肌颤发作;明显的肌阵挛发作;GTCS。除了首个孤立的尖波外，KD组皮质SWD、subcontinuous SWD、高幅棘波放电、多棘波放电阈值均高于ND组。两组大鼠海马痫样放电阈值均高于皮层，除了首个孤立的尖波，KD组右侧海马SWD、subcontinuous SWD、高幅棘波放电、多棘波放电阈值均高于ND组。此外生酮饮食显著抑制皮层多棘波的放电，KD组皮层多棘波放电次数显著低于ND组。在临床行为学观察上，KD组愣神样发作、首个肌颤发作、明显的肌阵挛发作、GTCS阈值明显高于ND组。痫样波（首个孤立的尖波）从皮质传导至右侧海马的时间两组间无差异。　　3.随着点燃次数的累加，两组大鼠行为学上均出现一系列的变化，发作等级总体上不断增加，发作时间上不断延长。共13次的点燃程序中，KD明显降低痫性发作的严重程度。KD组大鼠4、5级发作比例远少于ND组，而1级发作的比例则显著高于ND组。同时KD明显地延缓PTZ点燃的进程。相比于ND组，KD组明显延长肌阵挛发作和阵挛发作的潜伏期，缩短阵挛发作和大发作的持续时间。　　4.Ketocal及正常饮食各自喂养四周后(Pre-kindling)，相比于ND组，KD组皮质KCC2蛋白表达量明显增高;但在随后的PTZ点燃过程中明显肌阵挛和GTCS状态时KD组皮质KCC2蛋白表达量逐渐下调，但相比ND组在正常饮食喂养四周后(Pre-kindling)的皮质KCC2蛋白表达量亦无统计学差异。随着PTZ点燃次数的增加，KD组和ND组皮层KCC2的蛋白表达均呈动态下降改变，但在明显肌阵挛发作状态和完全点燃状态中KD组KCC2的蛋白表达量仍显著高于ND组。两组大鼠各自喂养4周后(Pre-kindling)皮质NKCC1蛋白表达无差异，在点燃过程中KD组皮质NKCC1的蛋白表达量有升高的趋势，但各状态的蛋白表达量之间重复比较没有统计学差异。然而在点燃过程中ND组皮质NKCC1的蛋白表达呈动态升高改变，且在明显肌阵挛和GTCS状态下皮质NKCC1的蛋白表达量显著高于KD组。　　结论:　　1.KD在PTZ诱发的急性致痫模型中通过提高绝大多数电临床发作阈值起抗惊厥作用，但不能阻止脑电临床发作的出现。　　2.KD在PTZ慢性点燃模型癫痫的形成过程中通过降低发作的严重程度和延缓大发作进程而具有延缓癫痫形成的作用。　　3.KD可能通过调皮质KCC2和NKCC1表达进而引起GABAA受体兴奋性改变来起到抗癫痫作用。