解旋酶是一类在生物体内普遍存在的蛋白酶，它在DNA复制、修复、重组、转录、维持端粒稳定、RNA加工翻译和降解方面具有非常重要的作用。研究表明DnaB解旋酶在细菌DNA复制过程中具有重要作用，其水解ATP获取能量催化双链DNA解链。在复制起始过程中，解旋酶需要和其他蛋白相互作用构成引发体才能共同完成DNA复制。解旋酶DnaB与引物酶DnaG是引发体的主体，二者相互作用可调控彼此的生物活性，DnaG能够促进解旋酶的ATP水解能力和结合DNA的能力，从而激活解链功能加快复制进程，而DnaB可激活DnaG合成RNA的能力，提高复制效率。已有的晶体结构表明，解旋酶形成双层平面环状六聚体;在结合引物酶C端结构域时，仍保持平面环状结构;而当解旋酶结合单链DNA时，解旋酶/ssDNA复合物则形成螺旋纤维状结构。但解旋酶在结合了单链DNA后如何和引物酶相互作用仍然不清楚。　　为了研究解旋酶与引物酶相互作用关系，探讨解旋酶与引物酶在DNA复制过程中的作用机制，本文重组表达了嗜热脂肪芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）来源的DnaB和DnaG及其C端结构域HBD，通过亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析制备了高纯度的重组解旋酶和引物酶蛋白。在此基础上，利用凝胶过滤层析制备了DnaB/ssDNA/DnaG(HBD)复合物，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测证明复合物中存在解旋酶、引物酶和单链DNA组分，动态光散射分析结果表明复合物是单分散的，均一的，可用于后续实验。　　通过孔雀石绿定磷法检测解旋酶ATP酶活性，发现解旋酶结合单链DNA和引物酶后其ATP酶水解活性明显提高。DnaB/ssDNA/DnaG复合物ATP酶水解活性是DnaB本身的2.3倍，DnaB/ssDNA/HBD复合物ATP酶水解活性是DnaB本身的2倍，表明全长引物酶比其C端结构域HBD对于解旋酶ATP酶水解活性的促进作用更为显著。从结构角度分析了单链DNA的结合以及引物酶的结合对于解旋酶ATP酶水解活性提高的原因，推测在解旋酶/ssDNA/引物酶复合物中，解旋酶发生了构象变化，使其NTP结合位点处的氨基酸残基与NTP相互作用增强，从而提高其ATP酶水解活性。　　将DnaB/ssDNA/DnaG(HBD)复合物进行结晶筛选和优化，得到了可用于衍射的晶体，结构解析发现复合物中无核酸存在，全长引物酶也发生了降解，整体结构为DnaB/HBD，推测可能是由于复合物不稳定，在结晶过程中ssDNA发生解离。分析影响复合物不稳定的可能因素，包括:1）池液的环境，池液组分可能影响了复合物的结晶;2）引物酶的结合，解旋酶/ssDNA复合物在结合引物酶后，引物酶诱导解旋酶更倾向于形成平面环状结构，不利于单链DNA的结合;3)DNA片段的长度及类型，DNA片段长度及类型可能会影响到解旋酶对DNA的亲和力，从而影响复合物稳定性和结晶。后续可从这些方面对复合物稳定存在和结晶进行深入的研究，以期获得复合物的晶体结构。　　冷冻电镜技术是研究蛋白质复合物三维结构的有效方法，遂尝试利用冷冻电镜技术解析DnaB/ssDNA/HBD复合物的结构。在复合物样品的电镜观察中，发现整个颗粒并不是平面六次对称的，而是具有一定的旋转对称特征，推测可能是因为解旋酶结合了单链DNA后，形成了螺旋状结构，在整个颗粒的外层有一处或者两处突出的密度，推测可能为结合的引物酶HBD。目前由于复合物样品主要存在动态性以及取向分布不均匀的特征，使得电镜三维重构分辨率较低，难以解析其精细结构。　　另外，本论文还对引物酶与含特异起始位点的单链DNA的结合模式进行了研究。重组表达了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)引物酶DnaG，DnaG全长蛋白在结晶过程中降解，最终解析了引物酶的RNA聚合酶结构域(RPD)的晶体结构。蛋白水解实验表明，蛋白易降解和稳定性差是全长引物酶不易结晶的可能原因。已有的RPD/ssDNA复合物、RPD/NTP复合物晶体结构明确了DNA结合的极性方向和NTP掺入的起始位置，在此研究基础上，利用定点突变技术对RPD中与单链DNA以及NTP结合有关的保守残基进行了突变，考察不同突变体与含特异识别位点的单链DNA的结合活性。根据RPD晶体结构信息和定点突变研究结果，结合前人研究结果提出了RPD/ssDNA/NTP结合模型，对引物酶在起始合成引物阶段识别模板DNA序列的机制进行了讨论。