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目的 观察马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei, PM)次级代谢产物对小鼠巨噬细胞株RAW264.7形态、活力和极化功能的影响,从形态学、细胞生物学和免疫学角度初步探讨马尔尼菲青霉次级代谢产物在病原体逃避宿主免疫防御中的作用。方法分离提取PM酵母样细胞在DMEM液体培养基37℃振荡培养的滤液,培养滤液与巨噬细胞RAW264.7共同培养：(1)光学显微镜观察PM培养滤液对巨噬细胞生长形态的影响。(2)糖原染色(PAS染色)观察PM培养滤液对巨噬细胞吞噬PM分生孢子能力的影响；(3)WST-8法检测PM培养滤液对巨噬细胞的毒性及增殖影响程度；(4)Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测PM培养滤液对巨噬细胞凋亡、坏死的影响程度；(5)ELISA法检测PM培养滤液对巨噬细胞分泌细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-10)的影响；(6)免疫荧光细胞化学法检测PM培养滤液对巨噬细胞表面标志CD16/32、CD206表达情况的影响。结果 (1)PM培养滤液作用于巨噬细胞RAW264.724 h～48 h,巨噬细胞生长密度降低,体积变大,肿胀变圆,部分胞浆内见空泡,少许细胞崩解。(2)10%～50% PM培养滤液作用于巨噬细胞,24 h时,实验组巨噬细胞吞噬PM分生孢子的吞噬率(%)和吞噬指数分别为83.687±6.279,5.969±1.170；48 h时,吞噬率(%)和吞噬指数分别为78.402±5.522,6.602±0.784；24 h、48 h吞噬率和吞噬指数分别与对照组比较均有显著升高(P<0.05)。(3)10%～40% PM培养滤液作用于巨噬细胞24 h、48 h, WST-8检测实验组巨噬细胞OD值分别为0.996±0.152,0.564±0.269,与对照组比较均有显著降低(24 h,P<0.0548 h,P<0.001)。流式细胞术检测细胞凋亡坏死：实验组巨噬细胞存活细胞率(%)、凋亡率(%)和坏死率(%)在24 h时,分别为76.41±10.99,9.13±4.10,11.03±8.34；48 h时,分别为58.91±21.00,13.18±5.51,18.14±12.73；24 h、48 h存活率分别与对照组比较均有显著降低(P<0.05)；凋亡率有显著升高(P<0.05)；坏死率无统计学意义(P>0.05)。(4)10%～60% PM培养滤液作用于巨噬细胞,24 h时,实验组巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-10浓度(pg/ml)分别为1807.300±193.759,4.769±3.736,3.180±1.141,35.431±16.005；与对照组比较TNF-α、IL-10、IL-12分泌量均有显著升高(P<0.05),IL-1β分泌量显著减少(P<0.01)。48 h时,实验组TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-10浓度分别为1491.307±695.238,7.153±4.128,4.084±1.631,20.878±11.696,与对照组比较TNF-α、IL-10分泌量均有显著升高(P<0.01),IL-1β分泌量显著减少(P<0.01),IL-12差异无统计学意义(P>0.05)。(5)免疫荧光细胞化学观察20% PM培养滤液作用于巨噬细胞,表达CD206,不表达CD16/32；巨噬细胞与PM分生孢子共同培养,同样仅表达CD206。结论(1)PM培养滤液中含有的次级代谢产物可以激活巨噬细胞表达CD206和分泌细胞因子TNF-α、IL-10。(2) PM次级代谢产物作用于巨噬细胞的早期(24 h～48 h)可能通过CD206的表达和TNF-α的分泌趋化巨噬细胞,增加其对PM的吞噬,同时PM次级代谢产物对巨噬细胞产生毒性,导致巨噬细胞凋亡、坏死增多。