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肝肉瘤样癌(sarcomatiod hepatocellular carcinoma,SHC)是指肿瘤的一部分或大部分被肉瘤样纺锤形或梭形肿瘤细胞替代,形态学上类似肉瘤的癌,原发于肝的恶性上皮性肿瘤,恶性程度高,预后差,十分罕见。但是肝细胞肝癌在抗癌治疗后发生肉瘤样转化率却高达20.9%。目前肉瘤样肝细胞肝癌缺乏有效的系统治疗手段,故阐明肝细胞肝癌肉瘤样转化的发生机制,寻找高效、高选择性的治疗靶点对提高肝癌疗效具有重要的意义。羧基末端结合蛋白1(C-terminal binding protien 1,Ct BP1)为转录辅抑制因子,能抑制上皮标记、抑癌基因和促凋亡基因的表达,从而促进上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition EMT)、细胞周期进展和抑制凋亡。目的:基于以上的背景知识和我们的前期研究成果,我们的研究目的为探讨Ct BP1在肝细胞肝癌肉瘤样转化过程中的作用,并进一步的为肉瘤样肝细胞癌的诊治提供新的分子靶点。方法:一.Ct BP1在肉瘤样肝细胞癌中的表达及临床意义1.收集肝细胞癌患者组织、癌旁组织及临床病理参数收集2008-2015年桂林医学院附属医院手术切除的肿瘤组织病理诊断为肉瘤样肝细胞肝癌组织标本13例和病理诊断为肝细胞肝癌的组织标本23例及其癌旁组织。相对应的癌旁组织距离肿瘤边缘5cm。用10%福尔马林固定所有的组织标本,石蜡包埋。患者在手术前均未进行过放化疗治疗。2.检测组织标本中Ct BP1的表达用HE和免疫组化法检测组织标本中Ct BP1的表达情况。二.过表达肝细胞癌细胞株的Ct BP1导致的影响1.细胞株的培养条件人肝细胞癌细胞株HUH-7、7402、7404、7721及Hep G2使用10%胎牛血清的DMEM培养基,在37℃、5%CO2、相对湿度95%的养箱内培养。2.肝细胞癌细胞株中Ct BP1的检测提取肝癌细胞株蛋白,通过Western blot法检测Ct BP1的蛋白表达水平。3.质粒提取及纯化从美国abcam公司购买过表达载体,转化、摇菌,提取质粒,Na AC-乙醇沉淀法纯化质粒。4.稳定细胞株建立穿梭载体PPAX2和包装载体PMD2G与表达质粒共转染293T细胞,生产慢病毒,采用Lipofectamine 2000法感染肝癌细胞株7402和7404,建立稳定携带Ct BP1的肝癌细胞株。5.过表达Ct BP1对7402、7404细胞的EMT和侵袭、迁移及增殖的影响转染Ct BP1后,用Western blot法检测7402、740细胞中Ct BP1的表达,通过q RT-PCR、Western blot、Transwell、Boyden小室、CCK-8和克隆形成实验检测EMT相关基因的表达、迁移侵袭能力和细胞增殖能力。结果:1.从免疫组化结果显示在癌旁组织、肝细胞肝癌组织和肉瘤样肝细胞肝癌组织中Ct BP1的表达与E-cadherin的表达呈负相关、与ki67的表达呈负相关。2.Western blot检测肝癌细胞株中Ct BP1的表达,结果显示各肝癌细胞株中都有一定水平的Ct BP1表达,其中HUH7、7721细胞表达较低,而7402、7404及Hep G2细胞Ct BP1的蛋白水平较高。3.在7402和7404细胞中外源性过表达Ct BP1,用Western Blot法检测Ct BP1表达水平明显上调。并且用Western Blot法检测了细胞上皮性标志E-cadherin表达下降,间充质标志分子N-cadherin、Vimentin表达上调。因此,Ct BP1引起了过表达Ct BP1的7402和7404细胞的间充质样表型和上皮间充质转化样的细胞分子标志物的改变。4.Transwell、Boyden小室迁移和侵袭实验进一步明确了过表达Ct BP1后促进了7402和7404细胞的迁移和侵袭能力。5.cck8和平板克隆形成实验结果显示过表达Ct BP1导致促进了细胞的增值能力。结论:就目前的结果我们初步认为Ct BP1介导了肝细胞肝癌的EMT从而促进肝细胞肝癌肉瘤样转化。本研究将为晚期肝癌患者的分子靶向治疗提供一定的理论基础。