论文部分内容阅读
本论文以DO-Stat法和人工神经网络动态模式识别控制法(Artificial Neural Network Pattern Recognition based control,ANNPR-Ctrl)为手段,对毕赤酵母流加培养生产融合蛋白HSA-IL-2过程中的甘油流加控制策略和性能指标进行了比较研究。在细胞生长期采用基于DO(溶解氧)/pH在线测量的ANNPR-Ctrl法特别有效。它可以有效地增加细胞的生产强度,缩短培养时间,使以甲醇为诱导剂的融合蛋白的诱导开始时间大幅提前。但是,在诱导期,甲醇浓度必须控制在一定水平才能实现融合蛋白的有效表达。同时,重组毕赤酵母菌(KM71,MutS)利用甲醇能力弱,无法利用DO和pH判断甲醇的过量或匮乏的状况。因此,在诱导期使用甲醇在线电极来控制甲醇流加,可以将甲醇浓度控制在设定范围之内,实现融合蛋白的有效表达。利用重组毕赤酵母菌(KM71,MutS)表达生产人白蛋白修饰的白介素- 2(HSA-IL-2)过程中,DO和甲醇浓度是影响目标蛋白表达的关键因素。实验发现HSA-IL-2生产菌对DO的需求不是很高,通过使用空气并结合调节搅拌转速就能满足其对DO的需求。诱导3天后,在正常DO、较低甲醇浓度下(DO 20-60%,甲醇浓度5-8g/L),HSA-IL-2表达量为23mg/L,为摇瓶表达量的2.5倍;在高DO、低甲醇浓度(DO 80%-120%,甲醇浓度2-5g/L)下,HSA-IL-2表达量可进一步提高18%,达到27mg/L;DO振荡、低甲醇浓度(甲醇浓度2-7g/L)条件不利于HSA-IL-2的表达;在正常DO、较高甲醇浓度下(DO 20-60%,甲醇浓度15-23g/L),HSA-IL-2表达量最高,达到44.6mg/L。诱导前期,甲醇浓度过高易导致菌体中毒,不利于HSA-IL-2的表达。此外,在诱导阶段,通过限制性添加甘油可以有效提高菌体的呼吸活性,促进菌体生长,并且缓解甲醇对菌体的毒性。本文还对重组毕赤酵母菌(GS115,Mut+)表达融合蛋白HSA-CP进行了初步研究。实验发现该菌对DO的需求很高。通富氧空气(50%,V/V)时最高菌体浓度OD600可达到600,约为通空气时相应值的1.8倍。与HSA-IL-2生产菌相比,该菌的诱导特性也不同。它利用甲醇能力强、诱导时间短,在5L发酵罐诱导15h内,HSA-CP蛋白表达量就可以达到最大值,而相应的摇瓶水平的最大蛋白表达量要在诱导3天才能达到。使用空气时HSA-CP最高表达量为108mg/L,略低于摇瓶;而通富氧空气时HSA-CP最高表达量可提高一倍,达到237mg/L。