【摘 要】
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多药耐药（Multi-drug resistance,MDR）是多种恶性肿瘤临床化疗过程中的主要障碍之一。根据MDR的发展机制一般可分为两大类,“泵抵抗”和“非泵抵抗”。“泵抵抗”的途径之一是由于P-糖蛋白（P-Glycoprotein,P-gp）在细胞膜上的过度表达,从而将入胞的药物排出细胞,降低细胞内药物浓度,使肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性。RNA干扰（RNA interference,RNA
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多药耐药（Multi-drug resistance,MDR）是多种恶性肿瘤临床化疗过程中的主要障碍之一。根据MDR的发展机制一般可分为两大类,“泵抵抗”和“非泵抵抗”。“泵抵抗”的途径之一是由于P-糖蛋白（P-Glycoprotein,P-gp）在细胞膜上的过度表达,从而将入胞的药物排出细胞,降低细胞内药物浓度,使肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性。RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术是指利用小干扰RNA（Small interfering RNA,siRNA）特异性结合靶基因并阻止靶基因的转录与表达,常与化疗结合以抑制P-gp的表达。除药物外排泵外,还有其他机制与MDR密切相关,研究表明肿瘤细胞的自噬在MDR发展过程中起着重要的作用。在缺氧、营养缺乏和放化疗等恶劣的生长条件下,自噬作为一种自身保护措施,可以捕获受损细胞器,并降解包括受损的细胞器、多余蛋白质和入侵的病原体在内的多种物质,回收能量以维持细胞内的稳态,从而阻止损伤的进一步扩大。自噬可以抵抗来自化疗药物对癌细胞的损伤,从而促进细胞对药物产生耐药性。因此,抑制自噬可有效增敏化疗药物,逆转耐药细胞的耐药性。本课题设计了一种透明质酸（Hyaluronic acid,HA）包裹的siRNA与紫杉醇（Paclitaxol,PTX）共递送纳米给药系统,它在抑制P-gp水平的同时,可以有效阻断耐药细胞的自噬过程。首先,我们合成了聚乙烯亚胺（1.8K PEI）和PTX的聚合物-药物结合物,命名为PEI-PTX（PP）,通过红外光谱、核磁氢谱等方式验证了结构的正确性。通过处方优化,筛选出PP/siRNA/HA的最佳质量比（3:1:6）,成功制备出平均粒径为144.4±1.0 nm、Zeta电位为-9.03±0.33 m V的核壳样PP/siRNA/HA纳米复合物,紫杉醇载药量为6.99±0.15%。在模拟血液环境下,PP/siRNA/HA具有良好的稳定性与生物相容性,能够保护siRNA免受核酶的影响。通过流式细胞术与共聚焦显微镜观察细胞对纳米复合物的摄取情况,PP/siRNA/HA能够有效促进细胞对siRNA的摄取,且PP/siRNA/HA以通过网格蛋白介导为主的内吞途径进入细胞,内化水平与CD44表达量有关。在体外逆转耐药实验中,通过免疫印迹试验（Western blot）和实时荧光定量PCR（RT-PCR）法测定A549/T中耐药相关基因的表达水平,结果显示PP/siRNA/HA可以有效抑制P-gp蛋白的表达。采用MTT法研究纳米制剂对A549细胞和A549/T细胞的细胞毒性,结果显示PP/siRNA/HA无论对A549细胞还是A549/T细胞均表现出较好的杀伤效果。通过流式细胞术考察了耐药肿瘤细胞凋亡和细胞周期,PP/siRNA/HA可以促进耐药细胞的凋亡,逆转肿瘤的耐药性。进一步的研究发现以PP为骨架的纳米复合物均可以通过阻断自噬过程,引起自噬体与自噬底物的增加,其中PP的自噬抑制作用具有浓度依赖性,高浓度的PP可以明显碱化溶酶体、阻断自噬流,且PP与PP/siRNA/HA的自噬抑制作用通过生物透射电镜得到确认。在体内抗肿瘤实验中,建立了小鼠皮下异位A549/T肿瘤模型,采用Cy5标记的siRNA通过小动物活体成像观察,考察了PP/siRNA/HA纳米复合物的体内分布。结果表明PP/siRNA/HA具有肿瘤靶向性,可以有效在肿瘤部位聚集。考察了PP/siRNA/HA体内逆转耐药效果以及抗癌效果,结果表明PP/siRNA/HA能够有效抑制耐药肿瘤的生长,抑瘤率达到63.57%。通过对肿瘤以及主要器官进行H＆E染色,表明PP/siRNA/HA可以有效引起肿瘤细胞的损伤,且不会导致主要器官受损,具有良好的生物相容性。肿瘤切片的Ki67免疫组化以及TUNEL免疫荧光染色结果显示PP/siRNA/HA可以显著抑制肿瘤细胞的增殖,引起肿瘤细胞的凋亡。通过Western blot和免疫荧光染色法考察PP/siRNA/HA对耐药相关蛋白与自噬相关蛋白的表达,结果表明PP/siRNA/HA纳米复合物在有效抑制P-gp表达的同时可以明显阻断自噬过程。综上所述,我们成功制备了一种新型基因/药物共载系统,在有效转染siRNA的同时可以引起细胞自噬体的聚集、阻断正常的自噬流,从而同时克服由P-gp引起的“泵抵抗”以及由自噬引起的“非泵抵抗”,并展现出优越的逆转耐药和抗癌活性。该策略将在克服肿瘤耐药方面显出巨大的潜力,为聚合物抑制自噬的研究提供了新的思路。
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