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目的:
1.筛选能够抑制Th17细胞分化的小分子化合物;
2.探讨SZB120抑制Th17细胞分化的机制研究;
3.寻找SZB120的直接作用靶点，并验证其在Th17细胞分化当中的功能;
4.探讨SZB120对IMQ诱导的小鼠类银屑病模型的治疗作用。
方法:
采用IL-17A-GFP小鼠体外提取na(i)ve CD4+细胞进行体外诱导分化，比较AKBA(11-羰基-β-乙酰乳香酸)与SZB120抑制Th17细胞的分化情况。细胞培养72h后，收集细胞，进行胞外染色后用BD Fortessa X20流式细胞仪进行检测。利用CCK-8检测小分子化合物抑制HaCaT细胞增殖的影响，细胞贴壁后，小分子处理24h后，每孔加入10μl CCK-8置于培养箱中继续反应，2h后用酶标仪检测细胞在450nm处测量吸光度。采用Cell Trace Violet燃料检测Th17细胞增殖，加入0.5μM、5μM SZB120至加入了细胞示踪染料的na(i)ve CD4+T细胞中，72h后上机检测CD4+IL-17+细胞的比例后同时查看细胞增殖的情况。采用Apoptosis试剂盒检测SZB120对Th17细胞的影响，Th17细胞培养72h，用e BioscienceTM Cell Stimulation Cocktail刺激4-6h，染色并进行流式上机检测。分析数据时gate CD4+IL-17+细胞进行分析。检测SZB120抑制Th17细胞的时相性，在Oh加入5μM SZB120和DMSO后，于24h、48h、72h、96h检测Th17细胞的比例。将na(ie CD4+T细胞诱导分化成Th1、Th2、iTreg，同时加入DMSO及0.5μM、5μM SZB120，72h分化完成后流式检测对应的指标。采用RNA-seq检测SZB120作用于Th17分化后相关基因的表达，分析IL-17A、IL-23R、IL-17F、CCL20等基因的表达情况。流式检测SZB120作用于Th17细胞分化后RORγt的蛋白表达情况。Western Blot检测24h、48h、72h的磷酸化的STAT3的蛋白表达变化。
依赖于靶点稳定性的药物亲和反应实验(DARTS)检测SZB120的直接作用靶点，银染后进行蛋白质谱鉴定。通过Western Blot验证EIF2S1为SZB120的直接作用靶点。分选na(i)ve CD4+T进行Th0或者Th17细胞诱导，在1h、4h分别收集细胞，提蛋白后跑胶，显影比较DMSO与SZB120处理后EIF2S1磷酸化的差别。运用GSK2606414联合SZB120作用于分化的Th17细胞，72h后流式检测Th17细胞的比例。同时比较DMS0、SZB120、不同浓度GSK2606414+SZB120各组别Th17细胞的比例。分选na(i)ve CD4+T进行Th17细胞诱导，4h后提蛋白，Western Blot检测DMSO、SZB120、4μMGSK2606414+SZB120的三组处理后EIF2S1磷酸化的差别。分选na(i)ve CD4+T进行Th17细胞诱导同时加入DMS0、SZB120，提蛋白后Western Blot检测IκBζ的蛋白表达情况。运用6-NBDG染料检测不同时间点SZB120对Th17细胞糖摄取能力的变化，同时运用Agilent Seahorse XF糖酵解压力检测试剂盒检测SZB120对Th17分化后不同时间点糖酵解的变化情况。运用GSEA软件分析RNA-seq数据，主要选用HALLMARK数据集进行分析。western Blot检测糖酵解相关蛋白的表达改变。
将小鼠随机分为Vehicle、DMSO、SZB120三组，DMSO与SZB120组每日给与咪喹莫特软膏刺激进行造模，同时给予SZB120或DMSO给药。每日测量体重，在第七天取小鼠病变部位皮肤进行HE染色、免疫组化查看各个相关的指标有无变化。造模给药结束后，提取小鼠脾脏细胞进行体外刺激，染色后流式上机检测，检测IL-17A的表达情况。同时取小鼠部分脾脏细胞进行研磨后提取蛋白，查看EIF2S1的磷酸化在各组小鼠脾脏中的表达情况。
结果:
结合CCK-8实验与Th17分化实验，选定SZB120进行后续研究的小分子化合物。SZB120在抑制HaCaT细胞增殖的同时，抑制Th17细胞分化有显著统计学意义(P＜0.001)，并且呈梯度依赖性。采用CTV实验显示Th17细胞的增殖并未受SZB120的影响。凋亡实验显示当gate CD4+/IL-1+细胞群时，发现SZB120从0.5μM开始有促进凋亡的趋势，且随着浓度增加，凋亡比例增高。从CD4+IL-17+细胞开始产生后，SZB120即会对其产生较强的抑制效果。在能够影响Th17分化的SZB120所用的浓度下，SZB120对Th1，Th2或iTreg的分化影响均无统计学意义(P＞0.05)。在Th17细胞极化条件下刺激72小时的SZB120处理的T细胞显示279个注释基因的差异表达，其中超过一半被下调。与DMSO对照相比，SZB120处理的细胞可降低工L17A，IL17F，IL22，IL23r，CCL20，CCR6的mRNA表达。SZB120影响转录因子STAT3的磷酸化水平但是不影响RORγt的蛋白表达。
运用DARTS的方法，银染后最后得到了肉眼可见的差异条带，通过质谱鉴定及Western Blot验证得到SZB120与EIF2S1互作。SZB120可促进EIF2S1的磷酸化，且一直维持到4h。与此同时，发现在Th0的条件下，SZB120同样能促进EIF2S1的磷酸化。加入2μM GSK2606414后，SZB120抑制Th17分化的能力受阻，有显著统计学意义(P＜0.001)。提取了不同条件下Th17分化后的蛋白，发现同时加入GSK2606414后，EIF2S1的磷酸化水平较只加入SZB120的情况下调。此外发现SZB120在促进EIF2S1磷酸化的同时可以下调IκBζ的表达。从24h开始，在含有0，2，5μM的SZB120的培养物中，Th17细胞的糖酵解能力存在明显降低的趋势。此外，在相同条件下使用CD4+T细胞中的6-NBDG(荧光葡萄糖类似物)测量葡萄糖摄取。正如预期的那样，葡萄糖摄取在活化后下调，并且这种抑制作用在第48小时最明显，有统计学意义(P＜0.001)。通过使用GSEA分析RNA-seq数据发现了SZB120可下调MYC靶向的基因组集、HIF1α引起的严重缺氧基因组，同时上调P53信号通路。同时检测了几个和糖酵解相关的蛋白的表达情况，发现了PFKFB3、HIF1α的下调。
SZB120显著改善了IMQ小鼠的形态特征。SZB120处理的IMQ小鼠中，表皮厚度与对照组相比有统计学差异(P＜0.001)。免疫组织化学还显示，与DMSO处理的模型组相比，用SZB120处理的小鼠皮肤中CD4+T细胞浸润明显减少。与DMSO处理的小鼠相反，在用SZB120处理的IMQ小鼠中Ki67+细胞的数量显著减少。通过流式细胞术检测了IMQ诱导的银屑病小鼠脾脏中CD4+细胞群体内IL-17+细胞的比例。发现SZB120处理的小鼠表达的IL-17表达细胞的比例较低。同时Western Blot检测脾脏细胞显示SZB120能上调其EIF2S1的磷酸化水平。
结论:
在本项研究中发现，SZB120可以通过与EIF2S1互作来抑制Th17细胞分化，从而减轻咪喹莫特诱导的小鼠类银屑病模型。本课题的研究阐明了SZB120能够抑制Th17分化并对其机制进行了探究，发现在引起EIF2S1磷酸化后，IκBζ的蛋白表达降低，而IκBζ是Th17分化重要的转录因子，故导致Th17分化受到抑制。SZB120作用于小鼠类银屑病模型后可显著改善银屑病相关的表型特征，故SZB120可成为治疗银屑病的潜力化合物。
1.筛选能够抑制Th17细胞分化的小分子化合物;
2.探讨SZB120抑制Th17细胞分化的机制研究;
3.寻找SZB120的直接作用靶点，并验证其在Th17细胞分化当中的功能;
4.探讨SZB120对IMQ诱导的小鼠类银屑病模型的治疗作用。
方法:
采用IL-17A-GFP小鼠体外提取na(i)ve CD4+细胞进行体外诱导分化，比较AKBA(11-羰基-β-乙酰乳香酸)与SZB120抑制Th17细胞的分化情况。细胞培养72h后，收集细胞，进行胞外染色后用BD Fortessa X20流式细胞仪进行检测。利用CCK-8检测小分子化合物抑制HaCaT细胞增殖的影响，细胞贴壁后，小分子处理24h后，每孔加入10μl CCK-8置于培养箱中继续反应，2h后用酶标仪检测细胞在450nm处测量吸光度。采用Cell Trace Violet燃料检测Th17细胞增殖，加入0.5μM、5μM SZB120至加入了细胞示踪染料的na(i)ve CD4+T细胞中，72h后上机检测CD4+IL-17+细胞的比例后同时查看细胞增殖的情况。采用Apoptosis试剂盒检测SZB120对Th17细胞的影响，Th17细胞培养72h，用e BioscienceTM Cell Stimulation Cocktail刺激4-6h，染色并进行流式上机检测。分析数据时gate CD4+IL-17+细胞进行分析。检测SZB120抑制Th17细胞的时相性，在Oh加入5μM SZB120和DMSO后，于24h、48h、72h、96h检测Th17细胞的比例。将na(ie CD4+T细胞诱导分化成Th1、Th2、iTreg，同时加入DMSO及0.5μM、5μM SZB120，72h分化完成后流式检测对应的指标。采用RNA-seq检测SZB120作用于Th17分化后相关基因的表达，分析IL-17A、IL-23R、IL-17F、CCL20等基因的表达情况。流式检测SZB120作用于Th17细胞分化后RORγt的蛋白表达情况。Western Blot检测24h、48h、72h的磷酸化的STAT3的蛋白表达变化。
依赖于靶点稳定性的药物亲和反应实验(DARTS)检测SZB120的直接作用靶点，银染后进行蛋白质谱鉴定。通过Western Blot验证EIF2S1为SZB120的直接作用靶点。分选na(i)ve CD4+T进行Th0或者Th17细胞诱导，在1h、4h分别收集细胞，提蛋白后跑胶，显影比较DMSO与SZB120处理后EIF2S1磷酸化的差别。运用GSK2606414联合SZB120作用于分化的Th17细胞，72h后流式检测Th17细胞的比例。同时比较DMS0、SZB120、不同浓度GSK2606414+SZB120各组别Th17细胞的比例。分选na(i)ve CD4+T进行Th17细胞诱导，4h后提蛋白，Western Blot检测DMSO、SZB120、4μMGSK2606414+SZB120的三组处理后EIF2S1磷酸化的差别。分选na(i)ve CD4+T进行Th17细胞诱导同时加入DMS0、SZB120，提蛋白后Western Blot检测IκBζ的蛋白表达情况。运用6-NBDG染料检测不同时间点SZB120对Th17细胞糖摄取能力的变化，同时运用Agilent Seahorse XF糖酵解压力检测试剂盒检测SZB120对Th17分化后不同时间点糖酵解的变化情况。运用GSEA软件分析RNA-seq数据，主要选用HALLMARK数据集进行分析。western Blot检测糖酵解相关蛋白的表达改变。
将小鼠随机分为Vehicle、DMSO、SZB120三组，DMSO与SZB120组每日给与咪喹莫特软膏刺激进行造模，同时给予SZB120或DMSO给药。每日测量体重，在第七天取小鼠病变部位皮肤进行HE染色、免疫组化查看各个相关的指标有无变化。造模给药结束后，提取小鼠脾脏细胞进行体外刺激，染色后流式上机检测，检测IL-17A的表达情况。同时取小鼠部分脾脏细胞进行研磨后提取蛋白，查看EIF2S1的磷酸化在各组小鼠脾脏中的表达情况。
结果:
结合CCK-8实验与Th17分化实验，选定SZB120进行后续研究的小分子化合物。SZB120在抑制HaCaT细胞增殖的同时，抑制Th17细胞分化有显著统计学意义(P＜0.001)，并且呈梯度依赖性。采用CTV实验显示Th17细胞的增殖并未受SZB120的影响。凋亡实验显示当gate CD4+/IL-1+细胞群时，发现SZB120从0.5μM开始有促进凋亡的趋势，且随着浓度增加，凋亡比例增高。从CD4+IL-17+细胞开始产生后，SZB120即会对其产生较强的抑制效果。在能够影响Th17分化的SZB120所用的浓度下，SZB120对Th1，Th2或iTreg的分化影响均无统计学意义(P＞0.05)。在Th17细胞极化条件下刺激72小时的SZB120处理的T细胞显示279个注释基因的差异表达，其中超过一半被下调。与DMSO对照相比，SZB120处理的细胞可降低工L17A，IL17F，IL22，IL23r，CCL20，CCR6的mRNA表达。SZB120影响转录因子STAT3的磷酸化水平但是不影响RORγt的蛋白表达。
运用DARTS的方法，银染后最后得到了肉眼可见的差异条带，通过质谱鉴定及Western Blot验证得到SZB120与EIF2S1互作。SZB120可促进EIF2S1的磷酸化，且一直维持到4h。与此同时，发现在Th0的条件下，SZB120同样能促进EIF2S1的磷酸化。加入2μM GSK2606414后，SZB120抑制Th17分化的能力受阻，有显著统计学意义(P＜0.001)。提取了不同条件下Th17分化后的蛋白，发现同时加入GSK2606414后，EIF2S1的磷酸化水平较只加入SZB120的情况下调。此外发现SZB120在促进EIF2S1磷酸化的同时可以下调IκBζ的表达。从24h开始，在含有0，2，5μM的SZB120的培养物中，Th17细胞的糖酵解能力存在明显降低的趋势。此外，在相同条件下使用CD4+T细胞中的6-NBDG(荧光葡萄糖类似物)测量葡萄糖摄取。正如预期的那样，葡萄糖摄取在活化后下调，并且这种抑制作用在第48小时最明显，有统计学意义(P＜0.001)。通过使用GSEA分析RNA-seq数据发现了SZB120可下调MYC靶向的基因组集、HIF1α引起的严重缺氧基因组，同时上调P53信号通路。同时检测了几个和糖酵解相关的蛋白的表达情况，发现了PFKFB3、HIF1α的下调。
SZB120显著改善了IMQ小鼠的形态特征。SZB120处理的IMQ小鼠中，表皮厚度与对照组相比有统计学差异(P＜0.001)。免疫组织化学还显示，与DMSO处理的模型组相比，用SZB120处理的小鼠皮肤中CD4+T细胞浸润明显减少。与DMSO处理的小鼠相反，在用SZB120处理的IMQ小鼠中Ki67+细胞的数量显著减少。通过流式细胞术检测了IMQ诱导的银屑病小鼠脾脏中CD4+细胞群体内IL-17+细胞的比例。发现SZB120处理的小鼠表达的IL-17表达细胞的比例较低。同时Western Blot检测脾脏细胞显示SZB120能上调其EIF2S1的磷酸化水平。
结论:
在本项研究中发现，SZB120可以通过与EIF2S1互作来抑制Th17细胞分化，从而减轻咪喹莫特诱导的小鼠类银屑病模型。本课题的研究阐明了SZB120能够抑制Th17分化并对其机制进行了探究，发现在引起EIF2S1磷酸化后，IκBζ的蛋白表达降低，而IκBζ是Th17分化重要的转录因子，故导致Th17分化受到抑制。SZB120作用于小鼠类银屑病模型后可显著改善银屑病相关的表型特征，故SZB120可成为治疗银屑病的潜力化合物。