核心蛋白聚糖对肺腺癌细胞生长侵袭的影响及其靶向治疗研究背景肿瘤演变的最终归宿取决于肿瘤与微环境的相互作用，两者的互动关系成为近年肿瘤研究的热点与难点。肿瘤的发生、发展、侵袭及转移可以看作是对这种动态平衡的破坏。细胞的微环境主要包括细胞外基质，直接接触的相邻细胞，生长因子、激素等可溶性介质及间质组织。核心蛋白聚糖(Decorin)是细胞外基质的重要组成成分，是一种在体内组织分布广泛，可以和多种生长因子及细胞因子结合，参与细胞生长调节及组织重塑过程的小分子蛋白聚糖。近年来在国际上广泛受注目。许多研究结果表明Decorin是一种抗增殖因子，与肿瘤的发生、发展、生长密切相关，极可能是一种肿瘤抑制物，这就提示Decorin有可能成为新的抗肿瘤药物。Decorin由一个球形的核心蛋白和一条含CS／DS的糖胺聚糖(GAG)组成。其分子量为92.5kDa，核心蛋白为40kDa，属于小分子间质性PG家族成员，又称为PGⅡ，PG40，因最早发现其具有修饰胶原作用又称为饰胶蛋白。为进一步了解decorin与肿瘤的关系，国内外学者通过直接干预、原位杂交和基因转染等技术对于肝癌、结肠癌、齿龈癌、卵巢癌、肾癌及胃癌等方面进行了研究。表明Decorin对多种肿瘤细胞有抑制作用，其机制可能是1)decorin可与转化生长因子-β(TGF-β)结合，抑制TGF-β的生物活性；2)decorin使p 21表达增加，抑制肿瘤细胞生长。目前已明确TGF-β和p21对肺癌有作用，但缺少decorin对肺癌细胞生长影响的研究报道，因此本课题以人肺腺癌细胞株A549及裸鼠移植瘤模型为研究对象，进行了三个部分研究：第一部分．decorin对人肺腺癌细胞株A549体外生长的影响；第二部分．decorin对人肺腺癌细胞粘附、迁延及侵袭能力的影响；第三部分．decorin靶向治疗裸鼠人肺腺癌A549移植瘤的实验研究。了解decorin对肺腺癌细胞体外生长及侵袭力的影响，并探讨其可能机制，进一步观察decorin对裸鼠移植瘤生长的抑制作用。旨在为探讨decorin在肺腺癌形成机制中的作用提供理论依据，为肺腺癌的治疗提供新的思路。方法1细胞培养人肺腺癌细胞株A549培养于RPMI-1640培养液中，取对数生长期细胞用于实验。2 MTT法检测decorin对人肺腺癌细胞A549生长的影响对数生长期细胞加入decorin,使最终浓度为0、2．5、5、10、20、30、40μg／ml，实验分为7组，每组设3个复孔。7组细胞分别培养0 h，24h，48h，72h，96h，120h后行MTT实验。酶标仪上测定波长为490nm，计算A549细胞的存活率。3流式细胞术检测细胞增殖和凋亡比率收集对数期细胞与浓度为0、5、10、20、30、40μg／ml的decorin共同孵育0-96h，收集细胞于离心管内，离心，洗涤，固定，染色，置流式细胞仪上，每份标本测定20000个细胞，测量速率为150～200个细胞／s。用MultiCycle for Windows软件分析被采集资料，计算细胞凋亡比率。4 RT-PCR法检测decorin对其mRNA的表达的影响收集对数期细胞与浓度为0、10、20、30、40、50μg／ml的decorin共同孵育24h，按照decorin的浓度分为5组，进行RNA提取，定量后以其为模板逆转录合成cDNA链，然后用引物进行PCR扩增，产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，decorin mRNA的表达量通过与内对照光密度的比较来判断。5 Elisa法检测TGF-β蛋白的表达收集对数期细胞，加decorin,使最终浓度为对照组0μg／ml、实验组30μg／ml，每个组设定3复孔，培养4d，激活标本，建立标准曲线，检测。6 Western blot法检测p21蛋白的表达收集对数期细胞，加decorin,使最终浓度为对照组Oμg／ml、实验组30μg／ml，细胞提取细胞中总蛋白，测定出样品的蛋白质含量，然后将蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色，转膜观察结果。7 decorin对A549、细胞体外粘附、侵袭及迁移的影响检测收集对数期细胞，加decorin,使最终浓度为对照组0μg／ml、实验组2.5μg／ml。包被及水化基底膜，接种及培养细胞，然后MTT比色法检测，计算细胞粘附率。Transwell小室铺Matrigel胶，培养细胞，趋化，固定，染色，显微镜下计数，计算侵袭率。包被及水化基底膜，制备培养单层细胞，用人工划痕法，在相差显微镜下随机选择5个100x视野内计算迁移到划痕空隙中的细胞总数。8构建移植瘤裸鼠模型检测decorin体内靶向作用构建移植瘤裸鼠模型后，decorin直接移植瘤内注射，观察其抗移植瘤生长效应，包括一般状况，局部实体瘤生长抑制率的测定以及病理组织学检测。取肿瘤组织，Western法检测P21蛋白的表达，EIlSA法检测TGF-β蛋白的表达。结果1在一定范围内，decorin对A549细胞存活率抑制呈浓度和时间依赖性(decorin浓度为30μg／ml作用96 h时抑制作用最明显)。2 Decorin作用于A549细胞后，G1期细胞数明显增多，S期细胞数明显减少，G2期细胞数则无明显变化，提示decorin可能延缓肿瘤细胞由G1期向S期的过渡。decorin作用A549细胞后，A549凋亡率升高，最佳浓度为30μg／ml，最佳时间为96 h。3 30μg／mldecorin作用96h，经RT-PCR扩增后，decorinmRNA的表达明显高于无decorin组。4 A549细胞经30μg／ml decorin作用96h，TGF-β蛋白表达水平明显降低(0.584±0.107，0.252±0.008)P＜0.0001。5 30μg／ml decorin作用96h，经Western检测，P21蛋白表达水平明显高于无decorin6 2.5μg／mldecorin作用A549细胞4天后，粘附率由0.462±0.034下降为0.142±0.024，P＜0.001。7 2.5μg／mldecorin作用A549细胞4天后，侵袭细胞数为164.09±9.52，显著低于无decorin组(229.89±10.72)P＜0.0001。8 2.5μg／mldecorin作用A549细胞4天后，迁移细胞数由57.75±2.42减少至11.33±1.23，显著低于无decorin组(57.75±2.42)P＜0.0001。9裸鼠移植瘤成瘤率为97.2％，平均成瘤时间为约30±3天。Decorin作用后，抑瘤率(％)为49.58％。肿瘤生长指数为1.02±0.71，明显低于对照组6.66±2.96。肿瘤结节重量为(1.19±0.71)g，明显低于对照组(2.36±0.46)g。心肝肾组织观察，结构均基本正常，未见有明显的组织损伤改变。Decorin作用后，P21蛋白表达水平明显高于无decorin组，TGF-β蛋白表达水平明显低于无decorin组(0.071±0.008，0.229±0.002)P＜0.0001。结论1 Decorin能够抑制A549肿瘤细胞的体外增殖，且这种增殖抑制作用呈剂量和时间依赖性。2 Decorin抑制肺癌细胞生长，其机制可能与上调p21，抑制TGF-β表达，阻滞肺癌细胞周期G1／S期转换，促进肺癌细胞凋亡有关。3 Decorin在体外可抑制肿瘤细胞粘附，迁移和侵袭能力。4 Decorin瘤体注射可抑制裸鼠移植瘤生长，且无明显的心，肝，肾等毒副作用。