芳维A酸氨丁三醇对角质形成细胞增殖和分化的影响银屑病是一种常见而易复发的慢性炎症性皮肤疾病，临床上以各种形态的红斑鳞屑为特征。其病理特点主要是表皮角质形成细胞（KC）的过度增殖、分化异常及真皮内明显炎症细胞浸润。它的病因及发病机制至今不明。现在认为银屑病是一种多基因促发的T细胞介导的免疫性疾病，涉及到遗传、感染、代谢异常、创伤及精神紧张等多因素对机体免疫系统的影响。维A酸类药物具有抑制表皮细胞增殖、促进细胞分化和抗炎的作用，单独治疗或与其它治疗方法联合治疗各型银屑病，均取得了较好的疗效。其治疗银屑病的机制虽不完全清楚，但可能与上述三者有关。目前，维A酸类药物根据其化学结构不同可分为三代。第三代维A酸多是受体选择性的，能特异性地激活维A酸信号途径，从而使药物的毒副反应降低，而疗效却可达到较高水平，因此第三代维A酸类化合物的研发备受关注。芳维A酸氨丁三醇属于第三代维A酸药物。它的化学结构类似TTNPB，是一种新型的选择性维A酸受体激动剂。芳维A酸氨丁三醇是否具有抑制表皮KC增殖，促使其正常分化的作用目前还不清楚。我们以KC的HaCaT细胞株作为研究对象，建立了增殖、分化特性与银屑病相似的细胞模型，从Hacat细胞内的角蛋白6（Keratin6，KRT6）的表达的变化、细胞形态的变化以及细胞增殖实验三方面来判断细胞增殖的情况；以转谷氨酰胺酶1（Transglutaminase1，TGase1）的表达变化作为KC增殖分化的观察指标。本研究采用逆转录多聚酶链反应方法（RT-PCR法）检测KRT6 mRNA和TGase1的mRNA的表达情况，用[³H]TdR渗入法检测HaCaT细胞在芳维A酸氨丁三醇作用前后的增殖变化。本研究最后比较了芳维A酸氨丁三醇与依曲替酸对HaCaT细胞的增殖和分化的影响的差异，以评价芳维A酸氨丁三醇对KC增殖和分化的影响，为芳维A酸氨丁三醇进一步应用于临床治疗银屑病及其它疾病提供理论基础。第一部分芳维A酸氨丁三醇对HaCat细胞增殖的影响目的：观察不同浓度和不同剂量的芳维A酸氨丁三醇对无血清培养的HaCat细胞的形态、KRT6基因的表达和。³H-TdR摄入的影响，探讨芳维A酸氨丁三醇对Hacat细胞的增殖的影响。方法：将不同浓度的芳维A酸氨丁三醇添加于无血清培养的50％生长的HaCat细胞培养液中(芳维A酸氨丁三醇的终浓度为10^-6-10^-9mol／L)，分别在孵育后6h、12h、24h回收总RNA，用逆转录PCR（RT-PCR）方法检测HaCat细胞增殖的特异性标记基因KRT6的mRNA表达情况，以判断HaCaT细胞的增殖情况。另外用高倍显微镜观察芳维A酸氨丁三醇作用后的形态学变化，以观察芳维A酸氨丁三醇对HaCaT细胞形态的影响。用[³H]TdR渗入法具体测定芳维A酸氨丁三醇对HaCaT细胞的增殖的影响。结果：芳维A酸氨丁三醇作用于HaCat细胞12小时后，0.001μm／l的芳维A酸氨丁三醇对HaCaT细胞内的KRT6mRNA的表达无显著影响，当其作用浓度达到0.01μm／l时，可显著下调KRT6 mRNA的表达，与阴性对照组相比存在明显差异，P＜0.05；然而，当芳维A酸氨丁三醇作用HaCat细胞24h后，各浓度实验组（0.001μm／l-1.0μm／l）与阴性对照组相比都存在明显差异，P＜0.05，提示随着时间的延长，小剂量的芳维A酸氨丁三醇也能有效的抑制HaCat细胞内KRT6 mRNA的增殖，HaCaT细胞对芳维A酸氨丁三醇的作用非常敏感，随着芳维A酸氨丁三醇的剂量的加大，HaCaT细胞内KRT mRNA的表达进一步下降，呈明显的剂量依赖性。以0.01μm／l浓度的芳维A酸氨丁三醇作用于HaCaT细胞，发现KRT6mRNA的表达随芳维A酸氨丁三醇作用时间的延长而减弱，即芳维A酸氨丁三醇抑制HaCat细胞增殖的作用具有时间依赖性。形态学上：芳维A酸氨丁三醇作用HaCat细胞24h后，出现细胞变小，分布稀疏，膜皱缩。用[³H]TdR渗入法观察各浓度芳维A酸氨丁三醇(终浓度为10^-6-10^-9mol／L)作用HaCaT细胞24h后，HaCaT细胞的增殖的变化，结果示0.001μm／l浓度的芳维A酸氨丁三醇可使HaCaT细胞显著抑制，同对照组相比，P＜0.05，随着剂量加大，其抑制HaCaT细胞增殖越明显，呈剂量依赖性，即随着剂量的加大，细胞增殖抑制越明显。结论：0.01μm／l—1.0μm／l浓度的芳维A酸氨丁三醇作用12h后能显著抑制HaCat细胞增殖，且具备剂量依赖性。在作用24小时这个时间点，0.001μm／l—1.0μm／l浓度的芳维A酸氨丁三醇能有效抑制HaCat细胞的增殖，同时具备剂量依赖性。芳维A酸氨丁三醇抑制HaCat细胞增殖的作用还具有时间依赖性。第二部分芳维A酸氨丁三醇对HaCat细胞的分化的影响目的：观察芳维A酸氨丁三醇作用于无血清培养的HaCat细胞后，细胞内TGase1基因的表达变化，探讨其剂量及时间曲线，以明确芳维A酸氨丁三醇对HaCaT细胞分化的影响。方法：选择不同浓度的芳维A酸氨丁三醇(10^-6-10^-9mol／L)分别添加于无血清培养的HaCat细胞培养液中，分别在添加后6h、12h、24h回收总RNA，用逆转录PCR（RT-PCR）方法检测HaCat细胞分化的特异性标记基因TGase1的mRNA表达情况，比较不同浓度芳维A酸氨丁三醇和作用时间的基因表达差异。结果：芳维A酸氨丁三醇作用于HaCat细胞6h、12h、24h后，在低浓度0.001μM／l芳维A酸氨丁三醇作用下，就能显著上调TGase1的表达，与阴性对照组相比存在明显差异，P＜0.05，随着浓度的加大，TGase1mRNA的表达随之增加，到浓度为1.0μm／l时，其表达达到最高，具有明显的剂量依赖性。重点观察了芳维A酸氨丁三醇浓度为0.01μM／l时，不同时间TGase1mRNA的表达的变化，结果示，TGase1mRNA的表达随芳维A酸氨丁三醇作用时间的延长而增强，在作用后6h，TGase1mRNA的表达显著增加，P＜0.05，在作用后12h、24h，TGase1mRNA的表达进一步增加，P＜0.05，表明芳维A酸氨丁三醇促进HaCat细胞分化的作用具有时间依赖性。结论：，0.001μm／l—1.0μm／l浓度的芳维A酸氨丁三醇作用HaCaT细胞6h、12h、24h后能显著促进HaCat细胞内的分化基因TGase1mRNA的表达，且呈剂量依赖性和时间依赖性。第三部分芳维A酸氨丁三醇及依曲替酸对HaCat细胞增殖和分化的影响的比较目的：比较芳维A酸氨丁三醇与依曲替酸对无血清培养的HaCat细胞增殖和分化的影响。探讨芳维A酸氨丁三醇的临床应用前景。方法：将不同浓度的芳维A酸氨丁三醇及依曲替酸(终浓度为10^-6—10^-9mol／L)分别添加于无血清培养的HaCat细胞培养液中，分别在孵育后24h回收总RNA，用逆转录PCR（RT-PCR）方法检测HaCat细胞增殖的特异性标记基因KRT6 mRNA、和细胞分化的特异性标记基因TGase1mRNA表达情况，比较两种药物对HaCaT细胞的增殖和分化的差异。结果：芳维A酸氨丁三醇及依曲替酸都可以显著抑制KRT6mRNA的表达，而且随着浓度的增加，其抑制KRT6 mRNA的表达越明显，但是，两者在同样的浓度下，对KRTmRNA的抑制未见明显的差异（P＞0.05）；同样，芳维A酸氨丁三醇及依曲替酸都可以促进TGase1mRNA的表达，且随着浓度的增加，TGase1mRNA的表达逐渐增加，但是两药物促进TGase1mRNA的表达程度无显著差异，表明芳维A酸氨丁三醇药物对HaCat细胞的增殖和分化的作用同同临床上常用的药物依曲替酸类似。结论：芳维A酸氨丁三醇对KC增殖和分化的作用类同于依曲替酸，但是芳维A酸氨丁三醇能特异性地激活维A酸信号途径，有利于避免由于其他的维A酸途径被激活而引起的不良反应，从而使药物的毒副反应降低至低水平，其治疗银屑病所引起的药物副作用明显小于依曲替酸，因此在将来有望替代依曲替酸用于治疗银屑病。