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特发性弱精症往往表现为除精子活力指标低于世界卫生组织参考值,其余精子质量指标均符合正常标准。研究证实,精子在睾丸和附睾中成熟,经历了精子细胞的初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞发育成功能性精子。这种独特的分化过程包含了一系列复杂的调控,组蛋白的甲基化和乙酰化以及非编码的小核糖核酸,共同促进精子的分化和成熟。某些蛋白异常表达,或表观修饰发生改变,影响下游基因的表达,阻碍了精子的发生,引起精子活力以及精子形态的异常,最终导致不孕不育的发生。精子发生过程调控异常往往是特发性弱精子症常见的发病原因。表观修饰,又称拟遗传学或表观遗传学,在精子成熟过程中发挥着重要作用。这不是由基因表达水平变化引起的表观遗传变异的基因组研究。前期研究中,我们收集了正常成年男性的精子样本,首次检测到人类精子鞭毛区VDAC蛋白的表达。我们进一步收集正常成年男性和特发性弱精子症患者精子样本,比较vdfac基因亚型(vdacl,vdac2,vdac3)mRNA表达差异,发现Vdac2基因与精子活力有相关性。我们推测在特发性弱精子症患者中是否也存在表观遗传修饰异常,导致了VDAC2蛋白表达异常,进而影响精子活力导致男性不育的发生?目的研究比较正常男性与特发性弱精子症患者精子vdac2基因启动子区甲基化水平差异,比较精子各项指标与甲基化水平的相关性,寻找特发性弱精子症潜在病因,为特发性弱精子症的临床诊疗提供新思路。材料和方法1、收集27个正常男性和25个特发性弱精子症患者精液标本,记录两组患者基本信息例如年龄,饮食习惯及精子各项指标,同时排除有明确诱因如精索静脉曲张,隐睾,生殖系统发育异常等患者样本。2、配置终浓度为5μmol/L、10μmol/L和15μmol/L5-脱氧杂氮胞苷培养液,加入小鼠精母细胞GC2-spd并在细胞培养箱孵育24和48h,提取总RNA,qPCR验证vdac2是否受甲基化调控。3、Promoter Scan预测vdac2基因启动子区以及分析该启动子区CpGs,构建含有VDAC2启动子区的载体质粒,双荧光素酶报告基因验证启动子区活性。4、提取52个标本基因组DAN,经由亚硫酸氢盐行甲基化修饰测序,分析比较两组vdac2启动子甲基化程度。结果1、qRT-PCR 结果显示 GC2-spd 经 15μmol/L 5’-AZA-CdR 处理 48h 后,vdac2 mRNA水平表达较对照组明显增高(P<0.05)。2、含有vdac2启动子区序列的载体质粒psi_CHECK-2-VDAC2转染进入GC2-spd细胞后,其荧光值高于阴性质粒psi_CHECK-2-NC,P<0.05,差异有统计学意义3、BSP结果表明,正常人完全没有甲基化、轻度甲基化以及中度甲基化克隆子数百分比分别为:83.65%±5.51%、8.73%±1.38%、7.61%±5.68%;特发性弱精子症患者完全没有甲基化、轻度甲基化和中度甲基化克隆子数百分比分别为:76.01%±6.94%、7.14%±1.86%16.62%±8.27%。两组比较 P=0.005、P=0.02、P=0.003,有统计学意义。整体样本精子活力与甲基化程度相关性分析显示:精子活力与完全没有甲基化百分比呈轻度正相关,与中度甲基化水平呈明显负相关。结论:1、vdac2mRNA基因的表达与基因组甲基化程度有关。全基因组去甲基化后,vdac2mRNA表达明显增高。2、精子活力与vdac2基因启动子区CpG岛(-1337～-1059bp)甲基化程度有关。3、IAS患者可能由于精子vdac2基因启动子区CpG岛甲基化水平增高,抑制了vdac2 mRNA的表达,导致经由VDAC2离子通道能量物质传递减少,精子尾部鞭毛活力减弱,从而引起特发性弱精子症的发生。