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松褐天牛Monochamus alternatus Hope为害松树,影响植株正常生长,同时是传播松材线虫病的国际检疫性害虫,给我国造成巨大经济损失。松褐天牛活动具有隐蔽性,化学防治、物理防治和生物防治的单一使用难以在较短时间内控制松褐天牛,因此,急需寻找一种环保高效措施防治松褐天牛。昆虫嗅觉在其寻找寄主植物取食和产卵交配场所起到重要作用,萜烯类挥发物对松褐天牛有一定的引诱效果,但对于松褐天牛成虫如何感知这些信息化学物质的机制还不明确。气味结合蛋白(OBPs)在昆虫嗅觉系统实行气味感知和运输过程中起着极其重要的作用,但对于OBPs在昆虫嗅觉中的功能还不明确。为此,本课题以松褐天牛为研究对象,在克隆了其触角9条MaltOBPs基因的基础上,分析MaltOBPs基因时空表达谱,测定MaltOBPs与寄主植物松树挥发物的结合特性,并分析松褐天牛成虫对气味物质的行为反应,以期为阐明MaltOBPs在松褐天牛嗅觉感受中的功能奠定基础。主要结果如下:1.松褐天牛气味结合蛋白(MaltOBPs)基因克隆克隆了松褐天牛9条MaltOBPs基因全长,MaltOBP6、MaltOBP7、Malt OBP12、MaltOBP13、MaltOBP14、MaltOBP15、MaltOBP16、MaltOBP18、MaltOBP20。9条MaltOBPs基因分别编码143、128、143、136、166、133、142、124、131个氨基酸,GenBank登录号分别为KF977559、KF977560、KF977565、KF977566、KF977567,KF977568、KF977569、KF977571、KF977573。通过氨基酸序列分析,5条OBPs基因MaltOBP6、MaltOBP13、MaltOBP14、MaltOBP15、MaltOBP16具有6个保守的半胱氨酸,属于Classic OBPs;而MaltOBP7、MaltOBP12、MaltOBP18、Malt OBP20具有四个保守的半胱氨酸,属于Minus-C OBPs。2.松褐天牛OBPs基因时空表达特性通过荧光定量PCR技术检测了MaltOBP6、MaltOBP7、MaltOBP12、Malt OBP13、MaltOBP14、Malt OBP15、Malt OBP16、MaltOBP18、MaltOBP20等9条基因在不同时期、不同组织的表达情况。结果表明,9条MaltOBPs主要表达于触角和腹末三节,也有基因高表达于足中,且在头、翅也有一定的表达量;而松褐天牛9条MaltOBPs基因在触角中表达量受交配状态、性别、发育时期而呈现差异。3.松褐天牛MaltOBP13表达纯化及结合特性构建pET30a-MaltOBP13重组质粒,将重组质粒转入BL21(DE3)中试表达成功,主要表达于包涵体中,通过包涵体变性和复性获得带有部分杂蛋白的融合蛋白液,由Ni sepharose high performanc的1ml预装柱纯化和recombinant bovine enterokinase酶切,获得MaltOBP13纯蛋白。以1-NPN为荧光探针进行荧光竞争结合实验,测定该蛋白与20种松树挥发物在酸性(pH=5.0)和中性(pH=7.4)条件下的结合特性。结果表明,MaltOBP13在酸性条件下与松树挥发物有较好的结合能力,在中性和酸性条件下与大部分单体物质有较好的结合特性。4.松褐天牛成虫对气味物质的行为选择依据实验室已有松树挥发物单体,结合MaltOBP13在中性条件下与挥发物结合力的反应及松褐天牛成虫生活史,分性成熟前(成虫羽化后4-8天)、后(成虫羽化后13-17天),分雌雄,通过Y-型嗅觉仪测定松褐天牛性成熟前后对挥发物的行为反应。结果表明,无论性成熟前、后,均对所选取的物质无选择差异性。