脐血细胞和骨髓来源的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)能诱导分化为神经细胞已见于诸多报道，但多为一些神经细胞特有表面标记（NSE、GFAP、NeuN等）和动物模型移植后行为学评定的研究，对其分化条件和机制少有阐述。Tau蛋白为一种神经元微管相关蛋白(microtubule-associated protein Tau，Tau)分子量55～64kDa者，它是脑内神经细胞的特有的支架蛋白之一，在细胞形态的维持、分化、成熟、神经内分泌活性、受体活化过程中起着重要的作用。研究在体外条件下诱导脐血细胞和MSCs分化为神经细胞后，Tau蛋白以及其磷酸化的表达差异，可进一步探讨脐血单个核细胞和MSCs在向神经细胞定向分化过程中神经细胞发育、形成的机制。　　本实验选择对神经干细胞增殖分化有重要影响的细胞因子bFGF和EGF作为干预因素，观察脐血单个核细胞和MSCs向神经样细胞分化过程中细胞形态的改变和神经特有分子Tau蛋白等的表达情况，探讨脐血单个核细胞和MSCs向神经细胞分化的机制和条件，为脐血单个核细胞和MSCs作为“种子”细胞，移植治疗某些中枢神经系统疾病（如Alzheimer病）提供理论和实验依据。　　第一部分 神经细胞特有标志物在人脐血单个核细胞表达　　目的:检测神经细胞特异性标志物在人脐血单个核细胞中表达情况，探讨人脐血单个核细胞向神经细胞分化的基础。方法:取健康自然分娩产妇脐血，密度梯度离心法分离单个核细胞，一部分细胞直接涂片，用免疫细胞化学检测涂片中是否有存在nestin，MAP2、神经元特异性的烯醇化酶(NSE)及星形胶质细胞特异性的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞，另一部分细胞用RT-PCR方法检测脐血单个核细胞中神经细胞特有分子巢蛋白(Nestin)，神经丝亚单位M(NF-M)、微管相关蛋白-2(MAP2)mRNA的表达。结果:脐血MNCs胞体小呈圆形，神经干/前体细胞特异性抗体Nestin阳性细胞、神经元特异性抗体MAP2和NF-M阳性细胞散在分布，阳性率分别为1.5％、3.4％和0.5％，未发现NSE、GFAP阳性细胞;RT-PCR检测发现，脐血MNCs中的nestin，NF-M及MAP2mRNA有阳性表达。结论:脐血单个核细胞中存在着神经干（前体）细胞和少量神经元样细胞，具有向神经细胞分化的潜能。　　第二部分 体外诱导人脐血细胞向神经样细胞分化　　目的:观察体外诱导脐血细胞向神经细胞分化过程中的细胞形态改变和神经细胞特有分子表达情况，探讨脐血细胞向神经细胞分化的机制和条件。方法:密度梯度法分离脐血单个核细胞(mononuclearcells，MNCs)，光学显微镜下计数活细胞数。取细胞悬液，以1×106/ml接种于T-75培养瓶内，置37℃，体积分数为5％CO2，饱和湿度培养箱内培养。实验分5组:Ⅰ组:未培养细胞;Ⅱ组:H-DMEM+20％胎牛血清培养液（对照组）;Ⅲ组:H-DMEM+20％胎牛血清培养液加入bFGF(浓度20ng/ml);Ⅳ组:H-DMEM+20％胎牛血清培养液加入EGF(浓度20ng/ml);Ⅴ组:H-DMEM+20％胎牛血清培养液加入EGF和bFGF(浓度均为20ng/ml)。培养细胞每3d半量换液，培养14d后，收集培养细胞，复苏冻存细胞，采用逆转录聚合酶链式反应(Reverse-transcript polymerase chain reaction，RT-PCR)技术检测培养前后神经干细胞特有分子Nestin和神经元特有分子:神经丝亚单位-M(neurofilament，NF-M)和MAP2的mRNA表达;免疫细胞化学的细胞爬片的制备:以1.0×106/ml细胞密度接种于6孔培养板内，孔内置预先用多聚赖氨酸处理过的盖玻片，用EGF和bFGF(浓度均为20ng/ml)刺激细胞生长，培养14天后取出盖玻片，进行免疫细胞化学检测。免疫细胞化学方法鉴定培养前后MNCs中Nestin及神经元特异性的烯醇化酶、NF-M、微管相关蛋白-2(MAP2)和星形胶质细胞特异性的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达。结果:倒置显微镜下观察刚分离的MNCs小、圆形。不加细胞因子培养14d后细胞主要为胞体较小的细长梭形，而在各组细胞因子作用下培养14d后，可见一些胞体较大、有数个粗长突起的细胞生长，相邻细胞突起连成网状，类似神经元。免疫细胞化学检测发现，经培养后Nestin染色阳性细胞数短暂升高，随后降低，最后转为阴性;而抗-MAP2、NSE、NF-M、GFAP阳性细胞数增多，且分布相对集中，阳性率分别为27.6％、18.4％、21.7％、24.6％。PCR检测Nestin结果与免疫细胞化学结果一致，表现为培养过程中有一短暂的升高，然后下降，最后转为阴性。在未培养的MNCs中NF-M、MAP2 mRNA的表达阳性;培养后NF-M、MAP2 mRNA表达上调。EGF和bFGF联合上调MAP2 mRNA的表达作用最强，其次为分别应用EGF、bFGF组，对照作用最弱。结论:脐血细胞经培养后可表达神经细胞特有分子并分化为神经细胞特有形态;细胞因子EGF和bFGF在体外能促进脐血细胞中神经细胞的增殖和分化，联合应用较单独应用具有更强的促进脐血细胞向神经样细胞分化作用。　　目的:探讨脐血细胞在培养前后及细胞因子诱导作用下，神经细胞特有分子Tau蛋白的表达。方法:用密度梯度离心法分离脐血单个核细胞，接种于含20％胎牛血清H-DMEM培养瓶内。以不加任何细胞因子的培养为对照组，其余3组分别加入细胞因子EGF+bFGF、bFGF、EGF，终浓度均为20ng/ml。倒置显微镜下观察细胞形态变化，RT-PCR方法检测脐血单个核细胞培养前后Tau蛋白基因mRNA，免疫细胞化学方法检测Tau蛋白阳性细胞，并以MAP2mRNA表达情况及MAP2阳性细胞作为阳性对照。结果:培养前，脐血单个核细胞胞体小呈圆形;培养后EGF+bFGF组细胞胞体较大，突起粗而长，EGF组细胞胞体呈梭形，有1-2个长突触，bFGF组细胞胞体胞体较小、有多个细长突起，形似星形细胞，对照组细胞形态类似于bFGF组，但数量较少。RT-PCR检测未培养脐血单个核细胞MAP2mRNA表达阳性而Tau蛋白mRNA呈阴性，培养后MAP2mRNA表达增强，Tau蛋白mRNA亦呈阳性;免疫细胞化学方法可检测MAP2及Tau蛋白阳性细胞在EGF+bFGF组、EGF组、bFGF组、对照组分别为33.5％、25.6％、19.6％、14.4％和29.8％、21.4％、15.3％、13.5％。结论:脐血细胞经培养后能表达Tau蛋白，细胞因子bFGF、EGF能增强这种作用，并具有协同效应。　　第四部分 骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中Tau蛋白表达的研究　　目的:观察新生豚鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells，MSCs)在细胞因子作用下在体外横向分化为神经细胞过程中，神经细胞特有功能结构Tau蛋白、Tau异常磷酸化位点pSer202的表达差异以及Tau蛋白的定量改变，以评价诱导生成的神经细胞的功能状态，探讨MSCs向神经细胞横向分化的机制。方法:用DMEM培养基加胎牛血清(DMEM/FBS)体外培养新生豚鼠MSCs并传代扩增;使用细胞因子EGF、bFGF和EGF+bFGF(终浓度均为20 ng/ml)诱导第4、8、12、16代MSCs向神经细胞分化，以神经细胞特有标记物NSE的表达为情况为阳性对照，用免疫细胞化学法检测MSCs诱导14d后Tau蛋白、pSer202阳性细胞率，ELISA法定量分析诱导后各组细胞Tau蛋白含量的变化。结果:未加细胞因子组的Tau蛋白阳性细胞少，ELISA检测Tau蛋白含量低下。用细胞因子诱导后，MSCs在形态上类似神经元，用免疫细胞化学检测显示各组Tau蛋白阳性细胞和NSE阳性细胞较对照组均明显升高(P＜0.05），如第4代MSCs经细胞因子体外诱导14d后，对照组、EGF组、bFGF组和EGF+bFGF组的Tau蛋白阳性细胞率分别为的(5.21±0.25)％、(12.64±0.45)％、(51.22±0.26)％和(66.32±0.77)％(组间比较P＜0.001); NSE阳性细胞率分别为(5.49±0.13)％、(14.50±0.37)％、(55.81±0.20)％和(66.27±0.69)％(组间比较P＜0.001); ELISA检测发现，随诱导分化时间延长，各组细胞中的Tau蛋白含量逐渐升高，第10d趋于稳定，第14d时第4代MSCs各组的Tau蛋白含量分别为(2.26±0.11)ng/ml、(5.57±0.24)ng/ml、(20.45±0.49)ng/ml和(23.11±0.79)ng/ml(组间比较P＜0.05)。各代MSCs在细胞因子诱导下有相同的变化趋势，如第8和12代MSCs在EGF+bFGF联合作用下Tau蛋白阳性细胞率均分别达到(70.59±0.73)％和(63.63±0.62)％，Tau蛋白含量为(24.03±0.46) ng/ml和(23.74±0.62) ng/ml，与第4代MSCs结果相比均无明显差异(P＞0.05)。本实验中pSer202在各代MSCs未诱导组和诱导组均未见表达。结论:间充质干细胞在向神经细胞分化过程中Tau蛋白的表达呈上升趋势且未发生过度磷酸化;EGF和bFGF均可增强这种作用，促进其向神经细胞分化，且具有协同效应。