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一、研究背景脓毒症(sepsis)是指机体对于感染的失控反应所导致可以威胁生命的器官衰竭,是危重病人重要的死亡原因之一。据国外流行病学调查显示,脓毒症的病死率已经超过心肌梗死,成为重症监护病房非心脏病人死亡的主要原因。全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)是机体非特异性免疫系统对细菌内毒素及其致炎因子的过度反应。酪氨酸激酶分为受体型酪氨酸激酶和非受体型酪氨酸激酶。Tec家族是近年来国外研究活跃的胞浆内酪氨酸蛋白激酶,属于非受体型酪氨酸激酶。X染色体骨髓酪氨酸激酶(bone marrow tyrosine kinase on chromosome X,BMX)是Tec家族中新发现的成员。近年来研究表明,BMX激酶参与一些慢性炎症性疾病和肿瘤如类风湿性关节炎、肾细胞癌等的发生。本实验以RAW264.7小鼠单核巨噬细胞为实验材料,用源自大肠杆菌的LPS诱发细胞炎症反应,用BMX特异性抑制剂BMX-IN-1进行干预,观察BMX激酶对LPS诱导单核巨噬细胞促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β产生的作用并探讨其可能分子机制,以进一步阐明脓毒症早期的炎症机制。二、研究目的探讨非受体型酪氨酸激酶BMX在LPS诱导小鼠RAW264.7单核巨噬细胞产生TNF-α和IL-1β中的作用。三、研究内容第一部分LPS对RAW264.7巨噬细胞BMX激酶表达的影响小鼠RAW264.7单核巨噬细胞常规培养后分LPS剂量效应和时间效应两方面进行研究。(l)剂量效应研究:加入不同浓度的LPS(0.01、0.1、1、10、100μg/m L)刺激24 h。(2)时间效应研究:加入0.1μg/m L的LPS分别刺激0、15min、30min、45min、60min和120min;采用Western Blot法检测细胞BMX激酶的表达和磷酸化水平。第二部分BMX-IN-1剂量和时间效应研究小鼠RAW264.7单核巨噬细胞常规培养后分BMX激酶特异性抑制剂BMX-IN-1剂量效应和时间效应两方面进行研究。(l)剂量效应研究:空白对照组常规培养25 h,LPS对照组先常规培养24 h,再用0.1μg/m L LPS刺激1 h。BMX-IN-1剂量梯度组预先加入不同浓度的BMX-IN-1(75 000 nmol/L、7 500 nmol/L、750nmol/L、75nmol/L)作用24 h,再用0.1μg/m L LPS刺激1 h。采用实时PCR法检测各组细胞内TNF-αm RNA的表达。与空白对照组和LPS对照组对比,得出BMX-IN-1最佳作用浓度。(2)时间效应研究:预先加入最佳作用浓度的BMX-IN-1分别作用0 h、2h、4h、8h、12h和18h,再用0.1μg/m L LPS刺激1 h。采用实时PCR法测量各组细胞内TNF-αm RNA的表达。得出BMX-IN-1的最佳作用时间。第三部分BMX激酶在LPS诱导巨噬细胞促炎性细胞因子产生中的作用研究按照随机数字表法将RAW264.7小鼠单核巨噬细胞分为4组:(1)空白对照组,用含10%FBS的DMEM培养液常规培养13h;(2)BMX-IN-1组,75 000 nmol/L BMX-IN-1作用12 h,再常规培养1 h;(3)LPS组,常规培养12 h,再用0.1μg/m L LPS刺激1 h;(4)BMX-IN-1+LPS组,先用75 000 nmol/L BMX-IN-1作用12h,再用0.1μg/m L LPS刺激1 h。用ELISA法检测各组细胞上清液中TNF-α和IL-1β的含量,实时荧光定量RT-PCR法检测各组细胞TNF-α和IL-1β的表达,蛋白印迹法检测各组细胞BMX、TAK1和p38MAPK的活性。四、研究结果第一部分LPS剂量效量Western Blot结果显示:LPS诱导RAW264.7细胞的BMX激酶的表达呈剂量依赖性。LPS剂量为1μg/m L孵育24 h时候,RAW264.7细胞BMX激酶的表达达到峰值。当LPS浓度<1μg/m L时,随LPS浓度的增加,BMX激酶的表达逐渐增强。当LPS浓度>1μg/m L时,随LPS浓度的增加,BMX激酶的表达逐渐减弱。LPS时间效量Western Blot结果显示:LPS(0.1μg/m L)诱导RAW264.7细胞的BMX激酶的表达呈时间依赖性。孵育15 min后,巨噬细胞BMX激酶磷酸化水平上升,在60 min时达到峰值,随后下降。第二部分BMX-IN-1剂量效应对各组细胞TNF-αm RNA表达进行计算,空白对照组设为1。LPS刺激后,巨噬细胞内TNF-αm RNA表达明显升高,显著高于空白对照组(P<0.01)。使用BMX-IN-1预处理后,细胞内TNF-αm RNA表达下降,75 000 nmol/L+LPS组的TNF-αm RNA表达为2.40±0.41,与LPS组比,差异有统计学意义(P<0.05)。7 500nmol/L组、750nmol/L组和75nmol/组TNF-αm RNA表达分别为2.65±0.48、2.91±0.57和3.00±0.59,虽低于LPS组,但差异均无统计学意义(P均大于0.05)。BMX-IN-1时间效应对各组细胞TNF-αm RNA表达进行计算,LPS组设为1,BMX-IN-1预处理2h组细胞内TNF-αm RNA为0.98±0.10,4 h组为0.92±0.07,8h组为0.88±0.20,12h组为0.76±0.07,18 h组为0.80±0.07。BMX-IN-1预处理8h组、12h组和18h组细胞内TNF-αm RNA表达与LPS组比,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。第三部分空白对照组和BMX-IN-1组细胞上清液中TNF-α和IL-1β含量相近,细胞中TNF-α和IL-1β的m RNA表达量也相近(P值均大于0.05)。LPS组细胞上清中TNF-α和IL-1β含量分别为(2293±393)pg/m L和(700±95)pg/m L显著高于空白对照组;细胞中TNF-α和IL-1β的m RNA表达量分别为2.97±0.17和3.07±0.60,显著高于空白对照组(P值均小于0.01)。BMX-IN-1+LPS组细胞上清中TNF-α和IL-1β含量分别为(1755±422)pg/m L和(457±135)pg/m L,显著低于LPS组(P值均小于0.01);细胞中TNF-α和IL-1βm RNA表达量分别为2.31±0.33和2.55±0.73,低于LPS组(P均小于0.05)。BMX-IN-1组中BMX激酶、TAK1蛋白和p38MAPK活性与正常对照组接近(P均大于0.05),LPS组细胞中BMX激酶、TAK1蛋白和p38MAPK活性分别为1.98±0.33、2.41±0.50、2.05±0.34,显著高于相应的空白对照组(P均小于0.01)。BMX-IN-1+LPS组的BMX激酶、TAK1蛋白和p38MAPK活性分别为1.00±0.17、1.04±0.10、1.67±0.27,低于相应的LPS组(P<0.01或P<0.05)。五、研究结论1.LPS可诱导RAW264.7细胞BMX激酶的表达,且与LPS呈剂量依赖关系;BMX激酶的磷酸化水平与LPS呈时间依赖关系。2.BMX-IN-1的最佳作用浓度为75 000 nmol/L,最佳作用时间为12h。3.BMX激酶通过TAK1-p38MAPK途径,促进了LPS诱导巨噬细胞产生炎性因子TNF-α和IL-1β的产生。