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目的:以LPS建立PD小鼠模型和细胞炎症模型,探讨虫草素(Cor)对PD模型DA能神经元的保护作用,并对其抗细胞焦亡机制进行探讨。方法:1.体内实验:C57BL/6小鼠双侧经鼻滴注LPS(1.0 mg/mL)20 μL/d,将小鼠随机分为对照组、LPS造模7d、14d、21d和30d组,观察其行为学、DA能神经元损伤情况以及炎症相关指标变化,以确定最佳造模条件,建立PD小鼠炎症模型。将小鼠随机分为对照组、LPS模型组和Cor组(2.5、5.0、10.0 mg/kg),以旷场、爬杆和滚筒实验检测小鼠运动功能,免疫组化法观察TH阳性细胞数和小胶质细胞Iba-1阳性细胞数。HPLC-ECD法检测DA及其代谢产物含量,TUNEL法观察细胞凋亡数。ELISA检测TNF-α和IL-1β含量。Western blotting 法测定 TH、iNOS、COX-2、TLR4、IκB、NF-κB p65、Caspase-1 p20、NLRP3、GSDMD和GSDMD-NT蛋白表达水平,初步探讨Cor神经保护作用及其作用机制。2.体外实验:制备条件培养液(CM):用1 μg/mLLPS处理BV-2细胞12h后收集培养上清液作为CM1;以Cor与LPS共同作用的BV-2细胞培养上清液作为CM2。将CM1加入Cor预处理4h的PC12细胞中,观察Cor对PC12细胞是否有直接神经保护作用。将CM2加入正常PC12细胞中,观察Cor干预后的CM对PC12细胞的毒性是否有变化。以MTT法测定PC12细胞存活率,Hoechst 33258核染色法观察细胞凋亡和Western blotting法检测Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平,观察Cor体外神经保护作用。1 μg/mLLPS作用于BV-2细胞12h制备细胞炎症模型。将BV-2细胞分为对照组、模型组和Cor组(o0.5×10-6、2.0×10-6、8.0×10-6μM)。MTT法测定BV-2细胞存活率,Griess法检测NO含量,ELISA检测TNF-α IL-1β和IL-18含量。比色法测定LDH释放率,扫描电镜观察细胞膜表面结构,免疫荧光法观察Iba-1和GSDMD-NT表达水平,RT-qPCR测定 GSDMD-NT 的 mRNA表达。Western blotting法测定iNOS、COX-2、TLR4、IκB、NF-κB p65、Caspase-1、Caspase-1 p20、NLRP3、ASC、IL-1β、IL-18、GSDMD和GSDMD-NT蛋白表达水平,探讨Cor神经保护的作用机制。为了进一步探讨Cor是否通过调控TLR4/NF-κB通路和NLRP3通路发挥神经保护作用,分别使用TLR4抑制剂CLi-095和NLRP3抑制剂MCC950,采用Western blotting法测定TLR4和NLRP3通路相关蛋白表达水平。结果:1.LPS经鼻给药成功建立PD小鼠炎症模型LPS双侧经鼻给药30天能选择性损伤小鼠SN-Str DA能神经元,诱导运动功能障碍,激活胶质细胞,促进神经炎症,成功制备PD小鼠炎症模型。2.Cor对LPS-PD小鼠DA能神经元保护作用及其机制研究(1)Cor对PD小鼠DA能神经元的保护作用:Cor能明显改善PD小鼠运动功能障碍,减少DA能神经元丢失,增加纹状体内DA含量,显示出较好的神经保护作用。(2)Cor抑制小鼠黑质区神经炎症:Cor能明显抑制小鼠SN部位小胶质细胞激活,显著减少TNF-α和IL-1β释放,明显下调iNOS和COX-2蛋白表达。(3)Cor抑制TLR4/NF-κB/NLRP3介导的焦亡相关信号通路激活:Cor能明显下调TLR4和IκB表达,抑制NF-KB p65活化后进入细胞核,显著减少NLRP3表达,同时明显下调Caspase-1 p20和GSDMD-NT蛋白表达。3.Cor对CM诱导的PC12细胞凋亡的保护作用(1)Cor可抑制CM1诱导的PC12细胞凋亡:Cor预处理明显抑制CM1诱导的PC12细胞损伤,使细胞存活率增加,凋亡减少,并显著抑制促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表达,上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,提高Bcl-2/Bax的比值,起到直接的神经保护作用。(2)CM2对PC12细胞的毒性作用下降:与CM1相比,CM2降低PC12细胞存活率和和诱导细胞凋亡的作用明显减弱,促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3表达显著减少,抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显增加,表明Cor可作用于LPS诱导的BV-2细胞,抑制后者的毒性,从而间接保护神经细胞。4.Cor对LPS诱导的BV-2细胞神经炎症的抑制作用及其机制研究(1)Cor抑制LPS诱导的BV-2细胞神经炎症:Cor可以有效地抑制LPS诱导的BV-2细胞过度活化,抑制NO含量增加,减少iNOS和COX-2蛋白表达,降低TNF-α、IL-1β 和 IL-18 含量。(2)Cor通过调控TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路抑制细胞焦亡:Cor可明显抑制LPS诱导的BV-2细胞LDH的释放,减少细胞膜孔形成,同时减少GSDMD-NT高表达。显著下调TLR4和IκB表达,抑制NF-κB p65从细胞浆进入细胞核,进而抑制NLRP3 活化,下调 Caspase-1 p20、ASC、IL-1β、IL-18 和 GSDMD-NT 表达水平。加入TLR4和NLRP3抑制剂后,TLR4通路和NLRP3通路相关蛋白表达明显下降,Cor与抑制剂表现出相似的作用。结论:Cor对LPS诱导的PD模型DA能神经元具有良好的保护作用,其机制可能与抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路的激活,从而抑制神经炎症和细胞焦亡有关。