内皮功能障碍是糖尿病血管疾病重要的病理基础,而线粒体在维持内皮细胞功能稳定中扮演了不可或缺的角色。高糖(HG)可引起血管炎症、氧化应激及线粒体功能障碍等,最终导致血管内皮损伤。NF-κB通路在血管内皮损伤发生和发展中起着极其重要的作用,沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)具有改善血管内皮功能障碍及延缓血管内皮细胞衰老的作用。姜科山姜属植物艳山姜(FAZ)是贵州省当地的民间习用药材,有研究表明其主要活性成分艳山姜挥发油(EOFAZ)对内皮细胞损伤有保护作用,但其作用的具体机制尚不明确。目的:1.研究NF-κB在HG诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤过程中的作用,探讨EOFAZ的保护作用。2.观察EOFAZ调节HG诱导HUVECs线粒体损伤,寻找防治HUVECs损伤的有效作用靶点。3.观察EOFAZ是否通过调控SIRT1/NF-κB通路而改善HUVECs线粒体损伤,进一步寻找防治内皮细胞线粒体损伤的关键作用靶点及保护措施。方法:1.体外传代培养HUVECs,取3-5代细胞用于实验。苏木素-伊红(HE)染色及吉姆萨(Giemsa)染色后用倒置显微镜观察细胞形态学改变。四氮唑盐比色法(MTT法)探索HG损伤HUVECs的最佳作用浓度及作用时间。建立HG诱导HUVECs损伤模型及EOFAZ预保护浓度梯度,并用检测乳酸脱氢酶(LDH)外漏量实验及MTT法验证。实验分对照组、HG组、HG+EOFAZ低剂量(EOFAZ浓度0.25μg/L)组、HG+EOFAZ中剂量(EOFAZ浓度1μg/L)组、HG+EOFAZ高剂量(EOFAZ浓度4μg/L)组、HG+吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐(PDTC)组、甘露醇(Mannitol)组。各组细胞以划痕实验检测细胞迁移能力。酶联免疫吸附测定(ELISA)检测白细胞介素-8(IL-8),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达,Western-blotting法检测血管细胞黏附分子-1(VCAM-1),血管细胞间黏附分子-1(ICAM-1),NF-κB p65,p-p65,IκBα蛋白表达水平。并用免疫荧光法进行NF-κB p65核转位检测。提取HUVECs核蛋白后检测NF-κB p65 DNA结合活性。2.HUVECs分为对照组、HG组、HG+EOFAZ低剂量(EOFAZ浓度0.25μg/L)组、HG+EOFAZ中剂量(EOFAZ浓度1μg/L)组、HG+EOFAZ高剂量(EOFAZ浓度4μg/L)组、HG+环孢素A(Cyclosporin)组。各组细胞用ELISA法测定测定丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px),过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α),caspase-3、caspase-9的表达;采用荧光探针JC-1法检测线粒体膜电位水平的变化,Western-blotting法检测线粒体动力相关蛋白1(Drp1)、线粒体融合基因2(Mfn2)蛋白表达水平,并分别提取HUVECs胞浆蛋白及线粒体蛋白后检测Bax蛋白的表达水平。流式细胞仪测定各组细胞凋亡及线粒体通透性转换孔(MTPT)的开放情况;用荧光素-荧光素酶法检测各组细胞的ATP含量。3.予优化siRNA SIRT1转染HUVECs的条件后,实验分为对照组、HG组、siRNA SIRT1组、siRNA SIRT1阴性对照组、siRNA SIRT1+HG组、EOFAZ+HG(EOFAZ浓度4μg/L)组、EOFAZ+siRNA SIRT1(EOFAZ浓度4μg/L)组。Real-time PCR法测定siRNA对HUVECs SIRT1 mRNA表达的影响,以及用Western-blotting法测定SIRT1、caspase-3、Mfn2、Drp1、p65、p-p65、IκBα、乙酰化NF-κB p65蛋白表达;用检测LDH外漏量测定反映细胞损伤情况;HUVECs线粒体可用MitoTracker Green荧光染料染为绿色,随之使用荧光显微镜观察各组细胞线粒体形态的变化;各组细胞用ELISA法测定TNF-α、IL-8、PGC-1α的表达;用荧光素-荧光素酶法检测各组细胞的ATP含量。结果:1.传代培养HUVECs,倒置显微镜观察细胞融合形成单层后呈铺路石状排列。MTT法检测确定EOFAZ(浓度为0.25-4μg/L)干预24 h后细胞活性没有明显改变(P>0.05)。而HG最佳浓度为35mmol/L,最佳作用时间为24 h,此条件下HG诱导HUVECs存活率为68.7%±3.4%(P<0.01),予浓度为0.25-4μg/L的EOFAZ预保护1 h后证实EOFAZ对HG诱导的HUVEC损伤呈现一定的剂量依赖保护作用。正式实验选择三个剂量的EOFAZ(0.25,1和4μg/L)来提供预保护。HG可显著诱导HUVECs的LDH外漏增加(P<0.01),与EOFAZ预孵育1 h可以明显降低LDH外漏水平(P<0.01);为了消除高渗性对HG诱导的LDH外漏的增加的影响,35mmol/L Mannitol孵育HUVECs对LDH外漏未见明显影响(P>0.05)。HUVECs经HE染色后,可见对照组细胞核染成蓝紫色,细胞饱满,细胞质染成粉红色。细胞呈铺路石形状,细胞之间排列紧密,形态比较均一;HG组细胞数目减少,细胞核居中,细胞间隙增大,周围模糊,形态异于正常;EOFAZ组作用后细胞形态明显较HG组规则,细胞间隙变小;HUVECs进行Giemsa染色后,可见对照组细胞核呈现为紫红色,细胞浆呈现淡红色。对照组的细胞核偏于一侧、体积正常;HG组的细胞膨大,细胞核居中;相较于HG组,EOFAZ组及Mannitol组细胞融合呈铺路石状,形态规整均一,细胞之间排列较紧密。划痕实验表明相较对照组,HG作用后细胞迁移能力显著下降(P<0.01),而预先给予EOFAZ孵育1 h后,细胞迁移能力明显增加(P<0.01);EOFAZ干预可使HG诱导HUVECs炎症因子TNF-α和IL-8的分泌显著下调(P<0.01)。加用NF-κB抑制剂PDTC干预后,可抑制HG诱导HUVECs ICAM-1和VCAM-1蛋白的表达(P<0.01)。EOFAZ预处理HG诱导的HUVECs后,ICAM-1和VCAM-1蛋白水平显著降低(P<0.01)。HG处理后可以显著降低p65和IκBα及增加p-p65蛋白水平(P<0.01),EOFAZ预处理后均可显著抑制上述变化(P<0.01)。免疫荧光法进行核转位检测结果显示HG可诱导HUVECs NF-κB p65由胞质移位进入细胞核,EOFAZ可以抑制HG诱导的NF-κB p65核移位;HG刺激可显著增加NF-κB p65的DNA结合活性(P<0.01),EOFAZ预处理1 h后NF-κB p65 DNA结合活性显著降低(P<0.01)。表明HG介导的NF-κB激活可被EOFAZ抑制,EOFAZ可能是通过抑制NF-κB激活起作用的。2.HG刺激HUVECs后MDA显著增加(P<0.01),而EOFAZ预保护可下调MDA的合成(P<0.01)。MPTP抑制剂Cyclosporin也可显著降低MDA的合成(P<0.01)。采用和HG组同浓度的甘露醇干预排除渗透压影响,和对照组比较未见明显改变;HG处理HUVECs后SOD及GSH-Px显著下降(P<0.01),而EOFAZ组与HG组比较可上调GSH-Px合成,差异有统计学意义(P<0.05),且显著提高SOD的合成(P<0.01)。采用和HG组同浓度的甘露醇干预排除渗透压影响,和对照组比较未见明显改变;同时Cyclosporin组较HG组也可显著增加SOD及GSH-Px的含量(P<0.01)。EOFAZ及Cyclosporin干预可使HG处理后的HUVECs JC-1绿色荧光翻转至红色,说明EOFAZ及Cyclosporin可增加HG诱导的线粒体膜电位水平下降;Western-blotting结果显示与HG组比较,EOFAZ组及Cyclosporin组Drp1蛋白表达显著减低(P<0.01);且EOFAZ干预可上调Mfn2蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05);HG组钙黄绿素平均荧光强度明显降低(P<0.01),提示HG导致了HUVECs MPTP的持续开放,EOFAZ或Cyclosporin预处理可明显提高HG处理后细胞内钙黄绿素的平均荧光强度(P<0.01),提示EOFAZ有助于HG处理后细胞MPTP稳定;HG干预后可显著导致caspase-3及caspase-9活性增强(P<0.01),而EOFAZ可不同程度抑制此作用。流式细胞仪检测HUVECs凋亡程度,可见予HG作用后细胞凋亡率显著增加(P<0.01),而EOFAZ预保护1 h后可明显使HG诱导的凋亡率下降(P<0.01)。HG处理后HUVECs胞浆和线粒体Bax蛋白表达相较对照组均有所上调,但线粒体Bax蛋白表达上调的程度更为显著(P<0.01),证明大量的Bax蛋白从胞浆转位至线粒体。在EOFAZ组及Cyclosporin组胞浆Bax和线粒体Bax蛋白表达相较HG组均下降。3.与对照组细胞相比较,当siRNA SIRT1浓度为30nmol/L时SIRT1 mRNA下降作用最为明显(P<0.01),因此随后实验选用30 nmol/L作为siRNA的转染浓度。用Western blot检测后发现,与对照细胞组相比Si RNA SIRT1转染后HUVECs SIRT1蛋白表达水平显著下降(P<0.01),caspase-3蛋白水平明显上调(P<0.01),而SiRNA阴性转染组和对照组相比细胞SIRT1和caspase-3蛋白表达无显著性差异(P>0.05)。siRNA SIRT1转染细胞后,LDH外漏率显著高于对照组(P<0.01),并且可显著促进HG诱导的HUVECs LDH外漏(P<0.01)。而EOFAZ预孵育1 h可以显著减少siRNA SIRT1转染诱导的LDH外漏(P<0.01)。为了确定EOFAZ对siRNA SIRT1诱导的HUVECs炎症因子表达的影响,使用ELISA测量TNF-α和IL-8的水平,siRNA SIRT1转染细胞后TNF-α和IL-8的水平显著高于对照组(P<0.01),且可显著促进HG诱导的HUVECs TNF-α和IL-8的水平(P<0.01)。EOFAZ预孵育1 h可以显著减少siRNA SIRT1转染诱导的炎症因子水平(P<0.01)。Western blot及RT-PCR检测显示HG刺激可显著抑制SIRT1 mRNA和蛋白的表达(P<0.01),siRNA SIRT1转染可使HG介导的SIRT1 mRNA和蛋白表达进一步下降(P<0.01),采用EOFAZ预保护可使HG及siRNA SIRT1转染诱导的SIRT1 mRNA和蛋白表达显著增加(P<0.01)。荧光显微镜显示正常HUVECs中线粒体表现为典型的融合长条状,而受损线粒体形态则转变为分散的小圆粒状(fission),siRNA SIRT1刺激后可见含fission线粒体的细胞数量明显增多(P<0.01),EOFAZ预保护可使细胞fission线粒体数量明显减少(P<0.01)。si RNA SIRT1处理可显著下调Mfn2蛋白并上调Drp1的表达(P<0.01),且可使HG介导的Mfn2蛋白表达进一步下调,与HG组比较差异有统计学意义(P<0.05),并使Drp1蛋白显著上调(P<0.01)。EOFAZ预处理可显著上调siRNA SIRT1诱导的Mfn2表达下降(P<0.01),且可显著下调Drp1的表达(P<0.01)。siRNA SIRT1转染后显著降低HUVECs ATP含量(P<0.01),且可使HG介导的ATP含量进一步下降,与HG组比较差异有统计学意义(P<0.05),而用EOFAZ干预后内皮细胞ATP含量明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。siRNA SIRT1转染后显著降低HUVECs PGC-1α含量(P<0.01),且可使HG介导的PGC-1α含量进一步下降(P<0.01),予EOFAZ预孵育可显著上调siRNA SIRT1引起的内皮细胞PGC-1α含量下降(P<0.01)。siRNA SIRT1可显著上调HUVECs p65和IkBα蛋白表达,且显著激活p65磷酸化即上调p-p65的表达(P<0.01)。HG可使HUVECs乙酰化NF-κB p65蛋白表达显著增加(P<0.01),siRNA SIRT1组HUVECs NF-κB p65蛋白乙酰化水平较HG组显著上调(P<0.01)。EOFAZ干预则可以显著降低HG组及siRNA SIRT1组NF-κB p65蛋白乙酰化水平(P<0.01)。结论:1.EOFAZ可以通过抑制NF-κB的激活改善HG诱导的HUVECs功能障碍。2.HG通过诱导MPTP开放、线粒体生物合成障碍及激活线粒体凋亡途径导致HUVECs线粒体损伤,EOFAZ对HG诱导HUVECs线粒体功能障碍具有抑制作用。3.EOFAZ可上调SIRT1的表达,对siRNA SIRT1引起的HUVECs线粒体损伤具有抑制作用。下调SIRT1表达可以通过影响NF-κB p65蛋白乙酰化水平激活NF-κB通路,EOFAZ可以调控SIRT1/NF-κB通路改善HG引起的血管内皮细胞功能障碍。EOFAZ作为SIRT1激活剂为寻找有效防治DM血管病变提供了新的药物和思路。