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目的:肿瘤的致死率在人类各类疾病中占据首位。治疗肿瘤的方法很多,其中食用真菌的抗肿瘤成分以其不良反应少、疗效显著等优点在肿瘤治疗方面有其独到之处。香菇C91-3是本课题组多年筛选的一株经生物发酵后其发酵液具有明显抗肿瘤、抗细菌作用的真菌。本实验提取香菇C91-3菌丝发酵液中的蛋白成分(LFP91-3)并对其抑瘤作用及相关机制进行初步探讨,为今后研制开发有效的抗肿瘤新药提供理论依据。 方法:取100只BALB/C小鼠,分别予腹水型肝癌H22细胞和腹水型宫颈癌U14胞腹腔荷瘤,各50只。荷瘤后随机分为5组:生理盐水(NS)组、环磷酰胺(CY)组、香菇C91-3菌丝发酵液提取蛋白(LFP91-3)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组。每组10只,荷瘤24小时后分别予NS、CYO.4mg、LFP91-350ug、100ug、150ug每日一次,每次1ml/只,腹腔注射,连续5日。分别观察两种肿瘤细胞荷瘤小鼠的生存期。另取50只BALB/C小鼠全部予腹水型肝癌H22细胞,右腋皮下荷瘤。分组及用药剂量同上,右腋皮下注射,每日一次连续10日。于接种肿瘤细胞后第13日处死小鼠,取瘤组织称重,并用福尔马林溶液固定,制备病理切片。研究LFP91-3对荷瘤小鼠的抑瘤作用及机制。 将体外培养的H22、U14、S180细胞株加入不同浓度的LFP91-3(5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml)培养不同时间后,MTT法计算抑瘤率。将一定浓度的LFP91-3加入H22、U14细胞中,不同时间后用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。取一部分加LFP91-3不同时间的H22细胞用戊二醛固定制备电镜标本,观察其超微结构。另取一定量经LFP91-3作用后的H22细胞提取DNA,观察其DNA变化。研究LFP91-3对体外培养的不同肿瘤细胞株的抑瘤作用及机制。 结果: 1.香菇C。,一。菌丝发酵液提取蛋白(LFP。、一3)能延长荷瘤小鼠的生存期,抑制肿瘤生长。LFPg,一3能显著延长荷瘤小鼠的生存时间:对由HZ:肿瘤细胞所致的腹水型荷瘤小鼠,LFP。:一31、11、m组的存活期的平均值分别为:22.90士2.34、27.40士2.55、31.90士4.02较NS组(16.60士1,56)有显著延长(P<0.05)。LFP。,一。11、111抑瘤效果强于CY组(21.90士1.73)(P(0.05)。对由Ul;肿瘤细胞引起的腹水型荷瘤小鼠,LFPg卜。I、11、m组的存活期平均值分别为:27.40土2.37、34.60士3.82、36.80士3.92较NS对照组 (18.80士2.21)有显著延长(P(0.05),LFPgl一。11、111组抑瘤效果强于CY组(25.90土2.22)(P(0.05)。对由H22肿瘤细胞所致实体肿瘤的小鼠, LFP。,一3能抑制肿瘤生长,LFPg,一。I、n、m组的抑瘤率分别为:50.37%、54.58%、74.13%,CY组抑瘤率为39.55%,与NS组比均有显著性差异(P<0.05),LFP,、一3各组抑瘤效果均强于CY组(P<0.05)。 2.LFP。:一3对体外培养的多种肿瘤细胞株有抑杀作用,能将肿瘤细胞的细胞周期阻滞到S期并诱导出细胞凋亡。LFP。,一3对H22、U,;、S:。。细胞生长有明显的直接抑制作用,其作用强度在一定范围内出现对浓度和时间的依赖性。H22、U:;细胞在LFP,卜3作用下,S期细胞所占比例升高,均出现S期阻滞,并诱导出凋亡。LFP。:一3对H22、U,;细胞凋亡的诱导也呈现浓度和时间的依赖性。H22细胞在LFP引一,作用下随时间的延长G。/G,期比率下降由73.6%降至64.7%,S期比率逐渐增加由12.6%增加至28.2%。U:4细胞在LFP,:一。作用下也表现出与H22细胞相似的结果:G。/G,期比率下降 (39.8%至31.1%)、S期比率逐渐增加(34.64%至43.8%)。H22、U、;细胞均在LFP,,一3作用24小时后出现凋亡,凋亡率随时间的延长而增加。电镜下观察经LFP。卜3作用后的HZ:细胞可见典型的凋亡表现。DNA琼脂糖电泳显示出典型的DNA“梯形”带(ladder)。 结论:LFP引一。在体内、外均有较好的抑瘤作用。体内实验中LFP,,一3能明显延长荷瘤小鼠的生存期并对实体肿瘤有明显抑制作用。 LFP,,一。在体外能直接抑制肿瘤细胞的增殖。流式细胞仪分析LFP,:一。 能有效地阻滞S期向GZ/M期发展并于体外诱导出肿瘤细胞凋亡。电镜下 可见凋亡小体。本实验证实了LFP,卜3具有抑瘤、杀瘤作用,其作用可能 是通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡及增强机体免疫功能来完成的。 本实验为进一步开发具有多功能的抗肿瘤新药提供理论依据。