目的：　　1.评估不同年龄阶段AD模型小鼠海马区域GRK5的质膜分布情况以及不同年龄阶段GRK5敲除小鼠和AD模型小鼠海马区域的磷酸化Tau蛋白表达情况。　　2.在细胞水平评估正常情况下GRK5-Gln41Leu和GRK5-Arg304His突变对GRK5膜质分布以及Tau蛋白磷酸化的影响。　　3.在 AD细胞模型中评估 GRK5-Gln41Leu和 GRK5-Arg304His突变对GRK5膜质分布以及Tau蛋白磷酸化的影响。　　4.通过三维分子对接模型探索 Gln41Leu的第41位氨基酸残基和 Arg304 His的第304位氨基酸残基突变分别对GRK5的功能的影响。　　方法：　　1.动物实验：在SPF环境下饲养的低龄组（4月龄~5月龄）和老龄组（14月龄~15月龄）的GRK5敲除小鼠中随机各取3只，检测海马区域磷酸化Tau蛋白表达情况，并以相同环境下饲养的同龄的APP/PS1双转基因小鼠作对照。随后在3月龄、9月龄和12月龄雌性APP/PS1双转基因小鼠中随机各取3只，取海马组织进行GRK5胞浆和胞膜分离，检测不同年龄阶段AD小鼠海马区域GRK5的胞浆和胞膜表达变化情况；　　2.细胞实验：根据前期对 GRK5基因筛查确定拟研究的两个 SNP位点：rs2230345和rs2230349，并分别构建相对应的突变质粒载体GRK5-Gln41Leu和GRK5-Arg304His；将突变质粒载体转染至神经纤维母细胞瘤（SH-SY5Y），检测两种突变型对SH-SY5Y细胞磷酸化Tau蛋白表达水平的影响；在SH-SY5Y细胞中分别予以1μM和5μM Aβ42刺激，24小时后分析GRK5在胞浆和胞膜表达情况；在转染了突变质粒的SH-SY5Y细胞中分别予以1μM Aβ42刺激，24小时后分析GRK5在胞浆和胞膜表达情况以及检测磷酸化Tau蛋白表达水平。　　3. GRK5蛋白的三维晶体结构：通过 Insight II/Builder程序显示野生型GRK5蛋白的三维晶体结构模型，并在此基础上预测和计算GRK5-Gln41Leu和GRK5-Arg304His的三维晶体结构模型。通过Discovery Studio(DS) Visualizer3.1软件来检验所有三维晶体结构模型的完整性。　　结果：　　1.在动物实验中，低龄组（4月龄~5月龄）的GRK5敲除小鼠海马区域的磷酸化Tau蛋白表达水平明显高于同龄的 APP/PS1双转基因小鼠（P<0.05）；胞膜相关的GRK5缺陷开始发生在9月龄APP/PS1双转基因小鼠且随着年龄增长胞膜GRK5缺陷越严重，而胞浆GRK5表达水平则逐渐升高。这种胞膜和胞浆的反向趋势在12月龄时具有显著差异（P<0.05）；　　2.通过对 GRK5基因多个 SNP位点筛查，挑选出两个在中国汉族人群中的最小等位基因频率大于1%的并且位于编码区的功能性SNP位点：rs2230345（GRK5-Gln41Leu）和rs2230349（GRK5-Arg304H）。　　3.转染了GRK5-Gln41Leu突变质粒的SH-SY5Y细胞磷酸化Tau蛋白表达水平无明显变化（P>0.05），然而转染了GRK5-Arg304His突变质粒的SH-SY5Y细胞磷酸化Tau蛋白表达水平与对照组相比显著升高（P<0.05）。　　4.终浓度为1μM Aβ42刺激SH-SY5Y细胞24小时即可出现胞膜GRK5表达水平下降（P<0.05），且随着Aβ42浓度增加胞膜GRK5表达水平下降更明显（P<0.01），相反胞浆GRK5蛋白表达水平则逐渐升高（P<0.05）；终浓度为1μM Aβ42刺激转染了突变质粒的SH-SY5Y细胞24小时，GRK5-Gln41Leu突变组胞膜GRK5表达水平与对照组相比显著升高（P<0.05），而GRK5-Arg304His突变组则显著降低（P<0.05）。相反GRK5-Gln41Leu突变组胞浆GRK5表达水平与对照组相比显著降低(P<0.05），而 GRK5-Arg304His突变组则显著升高（P<0.05）。　　5.终浓度为1μM Aβ42分别刺激两个突变组24小时，GRK5-Arg304His突变组磷酸化Tau蛋白表达水平明显高于对照组（P<0.05），然而GRK5-Gln41Leu突变组磷酸化Tau蛋白表达水平则明显低于对照组（P<0.05）。　　6. GRK5蛋白的三维晶体结构模型显示：GRK5-Gln41Leu的第41位疏水性氨基酸谷氨酰胺（Gln）由亲水性氨基酸（Leu）替代并位于CaM/PIP2结构域；GRK5-Arg304His的第304氨基酸残基精氨酸（Arg）被组氨酸（His）取代并位于激酶催化结构域。　　结论：　　1. GRK5敲除可导致模型小鼠早期Tau蛋白过度磷酸化，随着AD病程发展GRK5发生胞膜分布增多而胞浆分布减少的现象，引发功能性GRK5水平下降。　　2.在细胞水平GRK5的Arg304His突变升高磷酸化Tau蛋白表达水平，但不影响GRK5的质膜分布水平。　　3. GRK5的Gln41Leu突变在正常情况下对Tau蛋白磷酸化无影响，在Aβ刺激下保护了Tau蛋白磷酸化并且使GRK5稳定在细胞膜上。　　4.分子模拟推测GRK5的Gln41Leu突变可能是通过影响GRK5的CaM结合结构域影响膜上的GRK5稳定性，而Arg304His突变可能影响了GRK5的催化功能。