由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp. tritici)引起的小麦条锈病是小麦生产上的一个重要病害,挖掘抗病基因培育抗病新品种是防治小麦条锈病的最有效途径。本实验室已构建了小麦品种水源11与条锈菌生理小种CY31亲和互作的抑制性差减杂交文库,并获得大量差异表达基因,本研究从中挑选了3个基因进行初步功能分析。本研究首先在本实验室构建的亲和互作cDNA文库中筛选基因全长,未得到全长序列的基因再通过电子克隆或RACE进行延伸克隆。采取小麦品种水源11接种条锈菌生理小种CY31(亲和互作)与CY23(非亲和互作)后0h、12h、18h、24h、48h、72h、120h的小麦叶片,提取总RNA,反转录合成cDNA作为Real-time RT-PCR模板,对基因的表达模式进行分析,并做了有关基因的原核表达及构建VIGS体系。具体如下:1小麦过氧化物还原酶(Peroxiredoxin,Prx)基因,命名为TaPrx,根据已知EST序列设计引物,在cDNA文库中筛选得到其全长序列688bp, ORF489bp,编码162个氨基酸残基。TaPrx与水稻和拟南芥Ⅱ类Prx相似性分别为84%和76%,6-160aa为PRX5保守结构域。编码蛋白分子量17.36kDa,等电点5.32,含有一个保守的半胱氨酸残基,不含信号肽及跨膜结构域,亚细胞定位预测94%的可能性存在于细胞质。原核表达的融合蛋白分子量38kDa,Western blot结果显示制备的抗体能与抗原特异性结合。Real-time RT-PCR分析表明TaPrx基因在小麦与条锈菌的亲和与非亲和互作中均受诱导表达,分别在接种后24h,18h达到表达高峰,与ROS的表达模式基本一致,即均在24h前达到表达高峰,表明TaPrx基因与ROS的调节密切相关,TaPrx基因可能参与了小麦受条锈菌侵染后产生的ROS的清除与调节从而在抗病性中起作用。2小麦吞噬迁移蛋白(engulfment and cell motility protein,ELMO)基因,命名为TaELMO,利用筛选cDNA文库与电子克隆结合获得TaELMO基因的全长序列1155bp,ORF810bp,编码269aa,编码蛋白分子量30.657kDa,等电点5.51,亚细胞定位预测91%的可能性存在于细胞质,不含信号肽及跨膜结构域。Real-time RT-PCR分析表明TaELMO基因在小麦受条锈菌诱导后呈下调表达。3小麦中与玉米叶片坏死斑点(lethal leaf-spot 1,Lls1)同源基因,命名为TaLls1,利用RACE结合电子克隆得到其全长序列1927bp,ORF1605bp,编码534aa,编码蛋白分子量59.178kDa,等电点8.46。含叶绿体导肽、保守的Rieske[2Fe-2S]及非亚铁血红素铁结合域位点,第490-511位为跨膜结构域。Real-time RT-PCR分析表明TaLls1基因受条锈菌诱导表达,并成功构建TaLls1基因的VIGS体系。