论文部分内容阅读
猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、猪圆环病毒Ⅱ型（Porcine circovirus2，PCV2）、猪繁殖与呼吸综合症（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）、伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）这几种病毒引起的疾病在临床上常呈现出相似的呼吸和繁殖障碍症状，并且常常呈混合感染，给养猪业造成重大损失。依据常规病原学检测及临床病理变化很难作出准确的判断，尤其是多种病原混合感染时，难以进行早期快速检测，容易产生误判错判，因此建立一种快速准确能同时对多种病原进行检测的方法对疾病的诊断和防治具有重要意义，而兼有多重PCR和实时荧光PCR优点的多重实时荧光PCR方法可以应用于多病原混合感染的快速检测。多重实时荧光PCR包括荧光探针和荧光染料两类。探针多重实时荧光PCR的特异性较好，但由于受到实时荧光PCR仪器检测通道限制，无法同时进行四种以上的病原检测，而且设计多条探针会增加总成本。荧光染料多重实时荧光PCR是通过识别扩增产物熔解峰以达到检测目的，不受检测通道限制。荧光染料EvaGreen相比SYBR Green Ⅰ具有更高敏感性和稳定性，而且在多重检测中克服了对扩增子的结合偏爱性，因此EvaGreen更适合于多重实时荧光PCR，基于本研究建立的EvaGreen多重实时荧光PCR方法，能够快速有效的同时检测六种猪病毒，并具有简便易行、成本较低等优点。基于最终需要建立EvaGreen多重实时荧光PCR方法，本研究首先建立了六种猪病毒EvaGreen单重实时荧光PCR检测方法，其中六种病毒经实时荧光PCR扩增后产生的熔解峰能够有效区分，是各病毒单重实时荧光PCR优化的前提条件，通过选定的引物同时对目的核酸序列和非目的核酸序列扩增来检测特异性，结果显示PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、JEV和PRV均无非特异性扩增；并进行六种病毒的灵敏度检测，其中PCV2和CSFV的检测极限可达10copies/μl，PRV和JEV的检测极限可达25copies/μl，PPV和PRRSV的检测极限可达50copies/μl；分别选取各病毒的3个浓度进行批内和批间重复试验，变异系数均在5%以内，显示各病毒单重实时荧光PCR重复性良好。在六种猪病毒EvaGreen单重实时荧光PCR优化完成的基础上，建立一个EvaGreen多重实时荧光PCR体系，经实时扩增能够产生六个目的扩增产物的熔解峰，其中PCV2扩增产物的熔解峰相应的熔解温度（Tm）为77.7±0.29°C，PPV为79.5±0.36°C，PRRSV为82.2±0.30°C，CSFV为85.3±0.35°C，JEV为87.3±0.31°C及PRV为91.3±0.25°C，从而可同时对这六种病毒进行检测。通过分别加入靶基因和非靶基因进行扩增，以检测特异性，结果显示六种猪病毒在EvaGreen多重实时荧光PCR中均无非特异性扩增；并进行了灵敏度检测，灵敏度结果显示：PCV2、PRRSV和JEV的检测极限达到100copies/μl；PPV、CSFV检测极限可以达到250copies/μl；PRV的检测极限可以达到500copies/μl；同时进行了批内和批间重复试验，结果显示批内和批间重复的Tm变异系数均在5%以内。由于多病原混合感染也常出现在实际检测中，故选取几种较易发生混合感染的病毒组合进行灵敏度检测，其中在CSFV浓度为106copies/μl时，PCV2灵敏度可达250copies/μl；PCV2浓度为105copies/μl时，PRRSV灵敏度可达250copies/μl；PPV浓度为106copies/μl时，PCV2灵敏度可达500copies/μl；PCV2、PPV浓度分别为105copies/μl和106copies/μl时，PRRSV的最低检测极限为500copies/μl。本研究表明，六种猪病毒的多重EvaGreen实时荧光PCR方法具有较好的特异性、灵敏度、重复性。应用建立的EvaGreen多重荧光PCR方法对58份血清和60份组织样品分别进行了检测。58份血清样品中，PCV2的阳性率为19.0%，PRRSV的阳性率为24.1%，PCV2与PRRSV混合感染占总样品数10.3%；在对60份组织样品检测中，PCV2、PPV、PRRSV和PRV检出率分别为23.3%、15%、16.7%及5%，PCV2与PRRSV、PCV2与PPV及PCV2、PPV与PRRSV混合感染检出率分别为6.7%、5%及5%，而应用普通PCR检测组织样品，PCV2检出率仅为21.6%。通过比较分析，EvaGreen多重实时荧光PCR较普通PCR具有更高的灵敏度，并可最大限度节约检测时间。总之本研究成功建立了六种猪病毒EvaGreen多重实时荧光PCR方法，可以对这六种猪病毒进行快速准确地检测和鉴定。