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自然界中有多种环境因子,如紫外线、电离辐射和化学试剂等都会导致DNA发生损伤,包括碱基损伤、DNA加合物、DNA双链断裂、DNA单链断裂,最为严重的是DNA双链断裂(DSB),而电离辐射(IR)又是导致DNA双链断裂的重要因素,当使用IR诱导细胞发生DSB后,会有两种主要修复方法介入DNA损伤修复,划分为:非同源末端连接(NHEJ)和同源重组修复(HR),NHEJ修复为易错修复,而后者修复较为精确。DNA-PKcs是DNA双链断裂修复过程中非常重要的蛋白质分子,它的翻译后修饰对其活性起着决定性的作用,目前在蛋白质翻译后修饰领域中有很多种,多聚ADP核糖基化(PAR)修饰与乙酰化修饰就是其中的两种,其在染色质重塑、DNA修复、基因转录、细胞凋亡和肿瘤发生中起着异常重要的作用。而且磷酸化也在DNA修复中起重要作用。目的:(1)研究DNA-PKcs的PAR修饰及其对DNA-PKcs功能和DNA损伤修复的影响。(2)探索DNA-PKcs的乙酰化修饰。方法:(1)通过将细胞进行照射和未照射后,采用免疫共沉淀(Co-IP),免疫共聚焦荧光(IF),免疫印迹(western blot),以及流式细胞仪等技术手段检测细胞DNA-PKcs的PAR修饰程度变化,不同周期DNA-PKcs的PAR修饰程度,应用聚ADP核糖基化(PARP)抑制剂Olaparib后对于DNA-PKcs的影响以及对于修复通路选择的影响,并研究其调节机制;细胞克隆实验验证Olaparib对于细胞的毒性作用,细胞生长曲线验证DMSO,Olaparib,Olaparib+DNA-PKcs抑制剂NU7441对于细胞的毒性作用;报告基因检测Olaparib处置后对修复通路的选择影响;单独或组合使用Olaparib和NU7441后检查DNA-PKcs Ser2056,p-ATM的表达;单独或组合使用Olaparib和KU55933后检查DNA-PKcs Ser2056,p-ATM的表达。(2)使用免疫共沉淀方法(Co-IP)验证DNA-PKcs的乙酰化修饰,并且将其与未照射组比较,验证照射后不同时间的乙酰化程度;通过周期阻滞,验证不同周期DNA-PKcs的乙酰化程度;ASEB网站中利用Tip60序列及功能特性预测DNA-PKcs可能的乙酰化位点;检测DNA-PKcs截短体中乙酰化发生的区段;质谱实验寻找DNA-PKcs可能的乙酰化位点。结果:(1照射后,DNA-PKcs发生PAR修饰,并且随着照射剂量的增加,PAR修饰的程度会越来越高;Olaparib处理后,在10μM的浓度下,PAR修饰减少明显;通过TDR周期阻滞后,显示在S期PAR修饰最强;Western和激光共聚焦显示Olaparib处理细胞后激活DNA-PKcs的S2056位点磷酸化;激活NHEJ修复通路,而且增加细胞的放射敏感性;Olaparib处理增加了ATM磷酸化状态。(2)DNA-PKcs能够发生乙酰化,且在S期乙酰化作用最强,在照射后随着时间的延长,乙酰化修饰也增强;ASEB网站预测出乙酰化位点为:K1917、K3650、K4004;质谱实验结果提示乙酰化位点为K1870。结论:(1)DNA-PKcs能够发生PAR修饰,并且PAR修饰随着照射剂量的增加而增加,且在S期最明显;Olaparib处置细胞后,激活DNA-PKcs和ATM活性;NHEJ修复通路激活;细胞的辐射敏感性增加。(2)DNA-PKcs可以发生乙酰化,随照射后时间延长而增强,并且在S期最明显;乙酰化的可能修饰位点为:K1870、K1917、K3650、K4004。