细胞内氧化还原平衡对维持生命的正常运行发挥重要作用。细胞内的活性氧（ROS）与细胞内氧化还原平衡、信号转导等多种生物学过程有着密切的联系,过量产生的ROS会导致疾病的发生、发展。超氧阴离子自由基(O₂^·-)是细胞内产生的第一个ROS,是重要的调控因子,过量产生的O₂^·-会诱导细胞的凋亡以及各种疾病的发生,如神经退行性疾病,缺血再灌注损伤等。研究发现,O₂^·-存在于多个细胞器内,对细胞功能的调控发挥着各不相同且至关重要的作用。因此,探究各细胞器内O₂^·-浓度的动态变化对相关疾病的信号通路的调控作用,有助于解开多种疾病的分子机制之谜。但是,目前发展的检测O₂^·-的方法尚无法同时具备动态、可逆、实时检测各细胞器内O₂^·-的能力。因此发展有效的工具实现细胞器内O₂^·-浓度变化的实时检测是非常必要的。双光子荧光成像方法具有灵敏度高、穿透深度深、高时空分辨率等优点,是目前分析细胞器内活性小分子变化的重要手段。近年来发展了很多具有双光子荧光性质分子探针用来实现对细胞内O₂^·-的可视化研究,但兼具细胞器靶向性和动态可逆检测O₂^·-性质的分子探针还较少,这也限制了有关O₂^·-介导疾病信号通路的研究。因此,设计制备靶向细胞器,且能够动态可逆检测O₂^·-的双光子荧光探针是很必要的。本论文主要内容如下:1、设计合成了靶向高尔基体,动态可逆检测O₂^·-的双光子荧光探针CCA。CCA选用L-半胱氨酸为高尔基体的定位基团,与O₂^·-特异性反应的咖啡酸酯作为识别基团。CCA能够高选择性、高灵敏度、瞬时、可逆地检测O₂^·-。CCA在O₂^·-浓度0-5μM的范围内,可线性检测O₂^·-,线性方程是F=1621.51[O₂^·-]（μM）+631.98,线性相关系数为0.991,检测限是18 nM。CCA能够成像检测细胞高尔基体的O₂^·-浓度变化,并实现小鼠腹部以及肝脏部位的深度成像,穿透深度为350μm。通过对缺血再灌注的肝细胞及小鼠进行双光子荧光成像,发现肝脏缺血再灌注损伤过程中,过量产生的O₂^·-可以激活高尔基体凋亡蛋白caspase2导致细胞凋亡,同时还发现高尔基体内O₂^·-水平受肿瘤坏死因子（TNF-α）的正调控作用。实验结果揭示了小鼠肝脏IR过程中O₂^·-在高尔基体内调控的信号通路,阐明了O₂^·-介导IR损伤的分子机制,为肝脏IR损伤的治疗提供了新策略。2、设计合成了靶向细胞膜,瞬时检测O₂^·-浓度变化的双光子荧光探针CA-DPPE。CA-DPPE选用1,2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-和磷酸乙氨醇（DPPE）作为细胞膜的靶向基团,咖啡酸酯作为O₂^·-特异性识别基团。CA-DPPE具有高选择性、瞬时可逆检测O₂^·-浓度的特性。利用双光子荧光成像,我们成功的对细胞膜上O₂^·-浓度变化进行了检测。