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目的FL118是通过高通量筛选(HTS)化合物库得到的一种高效、低毒、抗耐药性强的新型喜树碱类抗癌药物。我们的前期研究表明,FL118能够通过抑制肿瘤细胞生长以及促进肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用,但其作用机制尚未明确。本课题旨在探讨FL118对人结肠癌的抗肿瘤效果及其作用机制。方法(1)细胞实验。首先检测FL118对人结肠癌细胞(HCT116和SW480)的抗肿瘤作用。应用不同浓度(1、2、5、10、20、50和100 nM)FL118处理结肠癌细胞48小时后,通过CCK-8实验检测FL118对结肠癌细胞活力的影响,同时对FL118的应用浓度进行优化。应用优化浓度的FL118处理结肠癌细胞48小时后,通过克隆形成实验检测FL118对结肠癌细胞增殖的影响;利用光学显微镜观察FL118对结肠癌细胞形态的影响;通过Hoechst–PI染色实验和Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测FL118对结肠癌细胞凋亡的影响;通过WB实验检测凋亡标志性蛋白Cleaved Caspase 3、Cleaved PARP、Bax和Bcl-2的表达情况,从而检验FL118对结肠癌细胞凋亡的影响。为了进一步研究FL118发挥抗肿瘤作用的机制,应用FL118处理结肠癌细胞HCT116后,通过ITRAQ技术对其中的差异表达蛋白进行分析,发现FL118能够下调结肠癌细胞中CIP2A蛋白的表达水平。为了验证FL118对CIP2A表达水平的调控作用,应用优化浓度的FL118处理结肠癌细胞48小时后,通过qRT-PCR实验检测FL118对CIP2A的mRNA表达水平的影响;通过WB实验检测FL118对CIP2A的蛋白表达水平的影响。已知CIP2A作为PP2A的内源性抑制剂,其发挥作用的经典机制是抑制PP2A活性。为了进一步确认FL118通过调控CIP2A表达水平发挥作用的机制,应用PP2A磷酸酶活性测定实验检测FL118对结肠癌细胞中PP2A磷酸酶活性的影响,同时应用WB实验检测FL118对结肠癌细胞中PP2Ac蛋白表达水平的影响。利用R语言对TCGA数据库中结肠癌相关的基因数据进行分析,从而了解CIP2A基因在结肠癌中的表达情况;应用qRT-PCR实验对结肠癌患者的临床样本进行分析,从而了解CIP2A的mRNA在结肠癌中的表达情况;应用免疫组化实验对结肠癌患者的临床样本进行分析,从而了解CIP2A蛋白在结肠癌中的表达情况及其与结肠癌的关系,确认CIP2A能否作为本研究的目标蛋白。为了进一步验证FL118通过调控CIP2A表达水平发挥抗肿瘤作用,将PP2A抑制剂OA与FL118联合应用处理结肠癌细胞,按照处理情况将细胞分为四组:对照组、OA组、FL118组以及OA+FL118组。通过PP2A磷酸酶活性测定实验检测各组结肠癌细胞中PP2A磷酸酶活性的变化,同时通过WB实验检测PP2Ac蛋白表达水平的变化;通过CCK-8实验检测结肠癌细胞活力的变化,并通过流式细胞术实验以及WB实验检测结肠癌细胞凋亡的变化。(2)动物实验。利用结肠癌细胞HCT116对小鼠进行皮下注射,构建肿瘤异体移植模型。将实验动物分成空白对照组、低浓度实验组(4 mg/kg/week)和高浓度实验组(8 mg/kg/week),各组实验动物采用灌胃方式给予相应剂量的FL118溶液。实验结束后,取出肿瘤,将小鼠的肿瘤组织以及主要组织(心、肝、脾、肺、肾、大脑)进行包埋保存。通过测量不同组别小鼠皮下肿瘤相对体积及重量来研究FL118对移植瘤体内生长的作用;通过TUNEL-DAPI染色实验检测FL118在动物水平对结肠癌凋亡的影响;通过HE染色实验检测FL118对移植瘤组织病理学的影响;通过免疫组化实验检测FL118对体内结肠癌凋亡及CIP2A蛋白表达水平的影响。通过测量不同组别小鼠体重的变化、对小鼠主要器官的组织切片进行HE染色、检测小鼠肝肾功能指标以及血常规检测实验对FL118的耐受性做出初步评价。结果(1)细胞实验。应用不同浓度(1、2、5、10、20、50和100 nM)FL118处理结肠癌细胞48小时后,CCK-8实验结果表明,FL118能够显著降低结肠癌细胞的活力,另将10 nM和20 nM选为后续实验浓度。应用优化浓度(10 nM和20 nM)FL118处理结肠癌细胞48小时后,克隆形成实验结果表明,FL118能够显著降低结肠癌细胞的增殖能力;细胞形态学观察实验的结果表明,FL118能显著影响结肠癌细胞形态,使其呈现凋亡趋势;Hoechst–PI染色实验以及流式细胞术结果表明,FL118能够显著诱导结肠癌细胞的凋亡,并具有剂量依赖性;在WB结果中,凋亡标志性蛋白Cleaved Caspase 3和Cleaved PARP的表达水平随FL118浓度的升高而显著上升,而Bcl-2/Bax比值逐渐降低,这一结果亦证实FL118能够诱导结肠癌细胞凋亡。ITRAQ结果表明,FL118能够使结肠癌细胞中多种蛋白出现差异表达,其中CIP2A蛋白受FL118调控后表达水平下降了约40倍,是所有差异表达蛋白中下调水平最高的一种蛋白。应用优化浓度(10 nM和20 nM)FL118处理结肠癌细胞48小时后,qRT-PCR实验结果表明,CIP2A的mRNA表达水平随着FL118浓度的升高而降低;WB实验结果表明,FL118能够显著下调CIP2A的蛋白表达水平。同时,PP2A磷酸酶活性测定实验结果表明,PP2A的磷酸酶活性随着FL118浓度的升高而显著上升;而WB实验结果表明,FL118并没有显著影响PP2Ac的蛋白表达水平。以上实验结果表明,FL118能够下调结肠癌细胞中CIP2A的表达水平,继而提高PP2A磷酸酶活性。利用R语言对TCGA数据库中结肠癌相关的基因数据进行分析的结果表明,CIP2A基因在结肠癌中异常高表达;应用qRT-PCR实验对结肠癌患者的临床样本进行分析的结果表明,CIP2A的mRNA在结肠癌组织中异常高表达;应用免疫组化实验对结肠癌患者的临床样本进行分析的结果表明,CIP2A蛋白在结肠癌中异常高表达,并且与结肠癌进展以及淋巴结转移水平相关。基于以上结果,我们以CIP2A为本研究的目标蛋白,做出了本课题的实验假说:在结肠癌中,FL118能够通过下调CIP2A表达水平继而提高PP2A磷酸酶活性来诱导结肠癌凋亡。PP2A抑制剂OA与FL118联合应用处理结肠癌细胞时,PP2A磷酸酶活性测定实验结果显示,与FL118组结肠癌细胞相比,OA+FL118组结肠癌细胞的PP2A磷酸酶活性显著降低;而WB结果显示,PP2Ac蛋白的表达水平并没有发生显著变化。CCK-8实验结果显示,与FL118组结肠癌细胞相比,OA+FL118组结肠癌细胞的活力明显升高;流式细胞术以及WB实验结果显示,与FL118组结肠癌细胞相比,OA+FL118组结肠癌细胞的凋亡率明显降低。上述实验结果在细胞水平验证了我们的实验假说,即在结肠癌中,FL118能够通过下调CIP2A表达水平继而提高PP2A磷酸酶活性来诱导结肠癌凋亡。(2)动物实验。测量不同组别小鼠皮下肿瘤相对体积及重量的结果表明,FL118能够抑制移植瘤的体内生长;TUNEL-DAPI染色实验的结果表明FL118能够诱导移植瘤组织中的结肠癌凋亡;HE染色实验结果表明,FL118能显著影响移植瘤组织病理学特征,使其呈现凋亡趋势;免疫组化实验结果表明,FL118能够诱导移植瘤组织中的结肠癌凋亡并抑制增殖,同时降低CIP2A蛋白的表达水平。上述实验结果在动物水平验证了本课题的实验假说,即FL118能够通过下调CIP2A表达水平诱导结肠癌凋亡。测量不同组别小鼠体重变化的结果显示,应用FL118治疗小鼠时其体重未出现明显下降,表明FL118对小鼠生长未产生显著影响;对各组小鼠主要器官进行HE染色的结果表明,FL118对小鼠的主要器官没有产生显著性损伤;检测小鼠肝肾功能指标AST、ALT及BUN水平的结果表明,FL118对小鼠的肝肾功能没有产生显著性损伤;血常规检测实验结果表明,FL118对小鼠的血常规指标未产生显著性影响。上述结果表明,动物对FL118具有良好的耐受性。结论在结肠癌中,FL118能够通过下调CIP2A表达水平继而提高PP2A磷酸酶活性来诱导结肠癌凋亡。意义在结肠癌中对FL118的抗肿瘤作用机制进行了深入研究,并初步评价了动物对FL118的耐受性,为FL118进一步研究和开发成为结肠癌的临床药物提供了实验基础。