背景肾结石是泌尿外科的常见病,是国内大多数医院泌尿外科住院病人中最常见的病种,总体发病率约为5%-10%。肾结石中80%为草酸钙结石,其治疗措施包括自然排石、药物排石、体外冲击波碎石、输尿管软镜激光碎石、经皮肾镜碎石取石、腹腔镜切开取石等,虽然治疗越来越微创化,但由于草酸钙结石复发率高,部分复杂肾结石患者通常又需多次手术,给患者家庭和社会带来了较大经济负担。因此,对肾草酸钙结石的发生、发展及其中相关联的分子机制和信号通路进行深入探讨,有助于减少肾草酸钙结石的发生、预防肾草酸钙结石的复发。既往研究表明,草酸钙结石的形成是一个复杂的过程,包括晶体过饱和,肾小管上皮细胞损伤,晶体粘附、聚集、成核和生长等;其中,高草酸刺激对肾小管上皮细胞的损伤目前被认为是结石形成的关键环节之一。但是,肾小管上皮细胞损伤的具体作用机制尚不明确。目的通过体外细胞实验及体内动物模型,运用分子生物学实验等方法及转录组测序,探讨TNFR1/NF-κB信号通路及内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress,ERS）在肾草酸钙结石发生发展中的作用。材料与方法1.使用人肾小管上皮细胞（HK-2）构建高草酸刺激的体外细胞培养模型,使用不同浓度草酸梯度刺激后,检测TNFR1及下游NF-κB通路相关蛋白的表达情况;2.用生理盐水及不同浓度草酸刺激HK-2细胞,检测细胞生长情况及与草酸浓度的对应关系,并在显微镜观察细胞死亡及草酸晶体形成情况;3.运用Western Blot（WB）检测草酸刺激后HK-2细胞内凋亡相关蛋白PARP的剪切情况,验证细胞死亡的方式;4.通过给小鼠腹腔注射乙醛酸,增加小鼠尿草酸排泄量,形成高草酸尿,建立小鼠草酸钙结晶模型,取小鼠肾脏组织进行HE染色,观察肾组织中草酸钙晶体沉着情况;5.初步建模完成后,再将30只小鼠随机分为对照组、草酸刺激模型组及ERS抑制剂组,分别给予等量生理盐水、乙醛酸、乙醛酸加ERS抑制剂TUDCA,观察各组小鼠肾脏外观及体重变化,并对各组小鼠肾脏进行切片和HE染色,然后对肾损害程度进行评分;6.通过TUNEL染色,检测三组小鼠肾脏细胞凋亡水平,并运用WB检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl2及Bax的表达情况;7.通过免疫荧光检测三组小鼠NF-κb通路蛋白及ERS蛋白的表达水平及定位,并运用WB进行检测验证;8.通过自噬流慢病毒检测各组细胞自噬溶酶体数量及自噬水平,并运用TUNEL染色及流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;9.通过JC-1法及流式细胞技术检测各组细胞线粒体膜电位（Mitochondrial Membrane Potential,MMP）变化情况;10.透射电镜观察各组细胞超微结构改变及溶酶体数量;11.构建草酸刺激NF-κB干扰慢病毒组,运用WB及流式细胞检测各组细胞NF-κB相关蛋白及ERS相关蛋白表达情况及各组细胞凋亡率;12.对正常HK-2细胞及草酸刺激后的HK-2细胞进行全转录组测序,测定其全部转录本信息,并进行统计分析,挖掘转录水平调控网络。结果1.体外细胞实验证明:高草酸刺激HK-2细胞可诱导TNFR1蛋白表达,并激活TNFR1下游NF-κB信号通路,且下游JNK信号通路未被激活;2.高草酸刺激体外可抑制肾小管上皮细胞生长,且随着浓度越高,抑制作用越强;WB证实细胞内Caspase-3底物PARP被切割,提示高草酸刺激通过诱导凋亡来抑制细胞生长;3.体内小鼠模型实验证实:和对照组相比,模型组小鼠外观肿胀,肾脏重量及肾损伤等级评分均显著增高（P＜0.05）;而抑制剂和模型组相比,肾脏质量显著减轻（P＜0.05）;4.TUNEL染色检测三组肾脏组织凋亡情况,发现草酸刺激模型组及抑制剂组细胞凋亡水平显著升高,但抑制剂组与草酸刺激模型组相比,凋亡水平显著下降,且差异均具有统计学意义（P＜0.05）,说明高草酸刺激可诱导HK-2细胞发生凋亡,而抑制ERS后,细胞凋亡水平下降,说明ERS参与了该过程;5.免疫荧光和WB检测ERS蛋白GRP78、CHOP及NF-κB及其抑制剂的蛋白水平;结果发现:草酸刺激模型组及抑制剂组GRP78、CHOP、NF-κB（胞核）蛋白水平升高,IκBα、NF-κB（胞浆）蛋白表达水平降低,差异具有统计学（P＜0.05）;而抑制剂组与草酸刺激组比较GRP78、CHOP、NF-κB（胞核）蛋白水平降低高,IκBα、NF-κB（胞浆）蛋白表达水平升高,差异具有统计学（P＜0.05）;结果证实草酸刺激可激活肾组织内ERS和NF-κB信号通路;6.JC-1法及流式细胞技术证实,与正常对照组比较,草酸刺激模型组及抑制剂组MMP显著降低,而抑制剂和模型组相比,MMP显著升高,差异均有统计学意义（P＜0.05）;WB验证各组线粒体融合蛋白OPA1和Mfn2表达情况,与JC-1及流式检测结果一致,提示ERS参与了草酸诱导的HK-2细胞线粒体失衡;7.构建草酸刺激的NF-κB慢病毒干扰组（sh RNA组）,WB检测各组细胞ERS及NF-κB信号通路相关蛋白,结果提示:相比对照组,草酸刺激模型组及sh RNA组细胞内GRP78、XBP1、p-EIF2、IκBα蛋白表达水平明显升高,NF-κB（胞浆）及IκBα蛋白表达水平明显下降,差异具有统计学意义（P＜0.05）;sh RNA组ERS相关蛋白GRP78、XBP1、p-EIF2、IκBα表达水平变化与模型组一致。而慢病毒干扰下调NF-κB表达后,sh RNA组NF-κB（胞浆）和NF-κB（胞核）蛋白水平降低;表明:尽管sh RNA组细胞仍处于高ERS水平,但NF-κB信号通路受到明显抑制;证明草酸通过刺激HK-2细胞ERS激活NF-κB通路;8.全转录组测序中,对关键RNA中的基因进行通路富集分析,选择最显著富集的前5个通路;结果发现,本课题研究的焦点NF-κB通路及ERS通路关键基因ATF6β等均被富集,从转录水平层面验证体外细胞实验及体外动物模型的结论。结论高草酸刺激可通过激活ERS,诱导肾小管上皮细胞内线粒体功能障碍,增强自噬,激活TNFR1/NF-κB信号通路,诱导肾小管上皮细胞损伤和凋亡,促进肾草酸钙结石形成。