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红花Carthamus tinctorius L.是菊科(Asteraceae)红花属一年生或二年生草本植物,在我国已有2100多年的栽培历史,也是我国唯一的栽培品种。红花是一种集药材、油料、饲料于一身的新兴特种经济作物。目前,对红花种子的油脂及花冠的色素已经进行了广泛而深入的研究,而对红花饲用价值的基础研究极少见报道。红花籽粒饲用的营养价值主要体现在以天冬氨酸为前体的必需氨基酸含量上。然而在红花去壳去油后籽粕中赖氨酸等必需氨基酸含量极低,制约了其在动物饲料工业上的应用。因此,提高红花籽粒中必需氨基酸含量,培育红花新品种显得尤为重要。但是,红花现有的遗传信息十分有限,不能满足我们从代谢工程的角度开展改善红花籽粒营养品质的研究。因此,挖掘与红花天冬氨酸代谢途径有关的基因资源对于提高红花籽粒必需氨基酸含量具有十分重要的研究意义和应用价值。鉴于上述分析,本研究开展了红花籽粒发育后期转录组文库高通量测序工作,在转录水平全面了解红花籽粒发育成熟过程中基因表达的变化情况,发掘红花籽粒天冬氨酸代谢途径重要候选功能基因,并分析这些基因在红花籽粒发育后期的表达及其与总游离氨基酸含量的关系,同时分离得到天冬氨酸代谢途径第一个关键限速酶CtAK1基因并进行功能初步分析。本研究一方面丰富了红花的遗传信息资源,为阐明CtAK1的生物学功能及解析其在红花籽粒天冬氨酸代谢途径中的作用机制奠定基础,另一方面也为红花籽粒品质改良分子育种工作提供了重要的遗传背景基础和科学依据。主要研究结论如下:1、应用IlluminaHiseq2000测序平台对红花籽粒发育后期3份材料进行转录组文库高通量测序,共获得超过6GB数据量,共138193个Unigenes,平均长度700bp,为后续分析提供基础数据。基因功能注释分析发现所有的Unigenes均得到注释,说明转录组数据拼接质量较高。Unigenes的CDS区预测共获得54291个CDS,占39.29%,其中长度在1000bp以上的序列有14509个,占26.74%。皮尔森系数法分析样品间基因表达水平相关性发现各样品间的相关系数在0.661-0.782之间,说明在红花籽粒不同发育时期基因的表达是不同的,即样品间存在一定程度的相似性,又有各自发育时期的特点。2、通过基因差异表达分析,共鉴定出1528个差异基因参与到131条代谢途径,其中参与到天冬氨酸代谢途径的Unigene有179个,参与到蛋氨酸代谢途径的Unigene有264个,参与到支链氨基酸代谢途径的Unigene有68个,参与到芳香族氨基酸代谢途径的Unigene有149个。在179个天冬氨酸代谢途径候选基因中去除注释信息重复的序列,共筛选到11条Unigene,它们分别是c14707_g1,c52815_g4,c55378_g1,c54079_g2,c67402_g1,c67326_g1,c12631_g1,c53058_g1,c18700_g1,c48258_g3,c46041_g1。3、利用RT-qPCR技术筛选出红花籽粒不同发育时期稳定表达的CtEF1A和Ct60S组合为内参基因,选取上述9个候选基因进行表达分析,同时检测总游离氨基酸的含量,通过二者相关性分析发现4个候选基因(c55378_g1,c67326_g1,c12631_g1,c48258_g3)的表达与总游离氨基酸的含量关系十分密切。同时与转录组测序数据进行相关性分析,发现候选基因的表达模式与转录组测序分析结果一致,证实转录组高通量测序分析的准确性,同时也获得红花天冬氨酸代谢途径重要候选基因,为进一步研究奠定基础。4、本研究选取红花籽粒天冬氨酸代谢途径第一个关键限速酶CtAK1进行基因克隆和功能验证。首先通过RACE和定点突变技术获得CtAK1及其突变体mCtAK1;利用DNA重组技术构建植物超表达载体pCAMBIA3301-CTP-(m)CtAK1,通过冻融法获得阳性农杆菌工程菌;采用Flora dip法转化拟南芥,分别收获5株CtAK1-OE和3株mCt AK1-OE T2代拟南芥种子。RT-qPCR分析表明:在T2代转基因拟南芥中,CtAK1-OE和mCtAK1-OE在转录水平的表达量分别提高2.94倍和4.4倍。总游离氨基酸含量分析表明:与野生型拟南芥相比,mCtAK1-OE拟南芥种子总游离氨基酸含量提高2.38倍,CtAK-OE拟南芥种子总游离氨基酸提高1.87倍。