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与α-环糊精、β-环糊精相比,γ-环糊精具有更大的空腔和更高的溶解度,因而可以包埋较大分子量的客体分子,具有广泛的应用前景。γ-环糊精是由环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin Glycosytransferase,简称CGTase,EC 2.4.1.19)催化淀粉制备而成。本课题以来源于Bacillus sp.G-825-6γ-CGTase为研究对象,探索了其酶学性质及催化淀粉产γ-CD的条件,对其进行了定点突变,研究了突变体的酶学性质。该研究能够为γ-环糊精的工业化生产提供参考。CGTase的纯化及酶学性质的研究。采用淀粉吸附法对CGTase进行纯化,纯化效果用SDS-PAGE凝胶电泳验证。结果表明CGTase粗酶液经一步淀粉吸附法纯化后,纯化倍数达到了9.88,回收率为34.20%,在电泳图上呈现单一条带,说明目标酶已达到了电泳纯。对分离纯化后的CGTase进行酶学性质的研究,结果表明:CGTase的最适温度和pH分别为50℃、8.5;在40~50℃下具有较好的温度稳定性;在pH 7~10范围内比较稳定,在此范围内的相对残余酶活保持在80%以上;Ca2+和Mg2+对酶活有激活作用,Ni2+、Cr2+、Cu2+对酶活有较大的抑制作用,其中Ni2+的抑制作用最明显。底物状态对γ-CD产率的影响。分别探索了不同相对分子质量的淀粉和不同链长的淀粉为底物时对γ-CD产率的影响,分别以玉米淀粉(Mw=3.36×107Da)、可溶性淀粉(Mw=6.55×105Da)、DE=15麦芽糊精(Mw=3.29×104Da)为底物时,γ-CD产率分别为7.91%、6.21%、5.11%,表明淀粉相对分子质量的降低导致了γ-CD产率下降,而以经异淀粉酶脱支的淀粉及以经4αGTase延长了侧链的淀粉为底物时,γ-CD产率分别为10.69%、10.43%,表明适当相对分子质量的底物和淀粉链长对于生产制备γ-CD具有重要作用。反应条件对γ-CD产率的影响。采用4αGTase对玉米淀粉进行预处理,探索了4αGTase添加量、CGTase添加量、CGTase反应时间及底物浓度对γ-CD产率的影响,结果表明γ-CD的最佳制备条件为底物浓度5%,4αGTase加酶量4 U/g淀粉,CGTase加酶量8 U/g淀粉,反应时间30 h,此条件下γ-CD产率为12.83%。CGTase的结构分析。采用生物信息学的方法对不同来源CGTase的氨基酸进行多重序列比对分析、采用Pymol软件对Bacillus sp.G-825-6γ-CGTase和B.circulans 251β-CGTase的结构比较,以及对CGTase底物结合凹槽处九个亚位点的分析。结果表明:Bacillus sp.G-825-6γ-CGTase与来源于B.firmus/lentus 290-3、Bacillus clarkii 7364的CGTase的序列相似程度分别为95%和70%;Y211在不同来源菌株的CGTase中高度保守;Bacillus sp.G-825-6γ-CGTase和B.circulans 251β-CGTase的结构相似,底物结合凹槽处位于-7亚位点附近的氨基酸对产物专一性具有重要影响,Y211位于-7亚位点附近。CGTase定点突变及突变体酶学性质研究。采用一步PCR法对CGTase的Y211进行了定点突变,经验证Y211成功突变成了L211。在此基础上研究了突变体的酶学性质,结果表明:突变体的酶学性质和野生酶相似。对突变前后的产物特异性比较发现,突变酶生成的环糊精中,γ-CD的比例从68.4%提高到了96.4%,说明突变体Y211L明显提高了γ-CD的特异性。