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背景:黑色素瘤是一种侵袭性极强的恶性肿瘤,在过去30年它是所有类型癌症中发病率增长最快的恶性肿瘤之一。虽然经历了几十年的研究和药物开发,但其治疗效果仍不理想,该肿瘤发生、发展的分子机制也尚未完全阐明。目前已知miRNA是一类非编码小分子RNAs,在转录后水平调控基因的表达,参与生物复杂生命过程的调控,尤其是肿瘤的发生和进展。因此,尝试通过对黑色素瘤miRNA及其靶基因和相关信号通路的研究,为黑色素瘤的早期诊断和治疗提供新依据。目的:预实验已经证实miR-125b在黑色素瘤中低表达,靶基因是MLK3。本实验通过构建miR-125b过表达稳转黑色素瘤细胞系,观察过表达miR-125b对细胞增殖、凋亡和周期的影响,确定miR-125b在黑色素瘤中的抑癌作用,并进一步探索与miR-125b发挥抑瘤作用相关的可能信号通路。阐明miR-125b在黑色素瘤中发挥抑癌基因作用的分子机制,为后期临床治疗提供依据。方法:构建microRNA-125b过表达慢病毒,转染原发性黑色素瘤细胞A375和侵袭性黑色素瘤胞SK-MEL-5,得到稳定转染细胞株。转染目的病毒的为实验组A375-125b up、SK-125b up,转染空载病毒的为阴性对照组A375-negative、SK-negative,未转染病毒的为空白组A375、SK-MEL-5。采用RT-PCR法检测各组细胞miR-125b的表达水平,MTT法检测细胞的增殖情况,流式细胞术检测细胞的凋亡和细胞周期。Western Blot检测靶蛋白MLK3的表达水平,及各通路上关键蛋白(p-C-jun、C-jun、ERK1/2、MEK2、p-AKT、AKT1)的表达水平。结果:1.RT-PCR结果显示:miR-125b在实验组细胞中的表达量较空白组、阴性对照组的表达量明显增多(P<0.05),证实miR-125b在转染细胞中有效过表达;而阴性对照组细胞中miR-125b的表达量与空白组无明显差异(P>0.05)。2.MTT结果显示:A375-125bup细胞与A375-negative细胞、空白组细胞相比增殖活性明显降低(P<0.05),而A375-negative细胞较空白组细胞增殖活性无明显差异(P>0.05);SK-MEL-5细胞与A375细胞的变化趋势相同。3.流式检测结果:A375-125bup细胞与A375-negative细胞相比早期凋亡率明显增高(P<0.05),G0/G1期的细胞比例明显增多而S期细胞比例减少(P<0.05);SK-125bup细胞与SK-negative细胞相比也有同样趋势的变化,均有统计学差异。4.Western Blot结果显示:MLK3在A375-125bup细胞中的表达低于A375-negative细胞中的表达(P<0.05),p-C-jun、C-jun、ERK1/2、MEK2、p-AKT、AKT1在A375-125bup细胞中的表达量较于阴性对照组细胞均下降(P<0.05);SK-MEL-5细胞各蛋白的变化趋势与A375细胞相同,证实过表达的miR-125b抑制靶基因MLK3的表达,并可能通过阻滞C-jun、ERK、AKT通路发挥抑瘤作用。结论:1.成功构建miR-125b过表达慢病毒载体,稳转成功的黑色素瘤细胞细胞内miR-125b的表达上调。2.MiR-125b表达上调能抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,细胞周期阻滞在G0/G1期,发挥抑瘤作用。3.MiR-125b的靶点为MLK3蛋白,而且对C-jun通路、ERK通路以及AKT通路均有影响。4.MiR-125b有望成为治疗人恶性黑色素瘤有效靶点。