草履蚧Drosicha corpulenta(Kuwana)(半翅目:蚧总科:绵蚧科),是一种聚集在枝芽处刺吸汁液取食的植食性昆虫,当虫口密度过大时往往会造成枝芽枯死。由于草履蚧体表分泌蜡质形成保护层,人工清除和化学防治难以对其进行有效控制,而大量化学杀虫剂的使用不仅会灭杀天敌,还会对果实和环境造成污染。因此本文从昆虫化学通讯对害虫防治的角度出发,对草履蚧触角中参与嗅觉形成过程的相关蛋白进行研究,发现嗅觉基因在蚧虫中的作用,为今后的生物防治提供新的视角及理论依据。本文的研究内容包括:(1)对草履蚧雌成虫触角转录组进行测序,并进行组装、注释和同源性分析;从Unigenes中预测草履蚧嗅觉基因并归纳基因信息;对草履蚧的气味结合蛋白(OBPs)及化学感受蛋白(CSPs)序列进行比对,并构建系统发育树;(2)在转录组测序和分析的基础上,得到气味结合蛋白OBP(DcorOBP4,5,6,7,8,14)和化学感受蛋白DcorCSP2的编码序列;利用生物信息学方法分析其序列信息,并构建三维结构。结果如下:1.本文对草履蚧雌成虫触角转录组进行高通量测序。在转录组中,共获得33,741,845条序列标签reads,其中16,334条非重复序列unigenes被组装。这些unigenes通过GO分析和eggNOG分析进行基因功能的分类统计。草履蚧触角中unigenes与其他物种相似性比较发现,与豌豆蚜相似的数量最多,达到18.31%。2.本文从unigenes中预测到16条编码气味结合蛋白OBPs的基因、2条编码化学感受蛋白CSPs的基因、1条编码感觉神经元膜蛋白SNMP的基因、21条气味受体基因ORs和7条编码味觉受体GRs的基因,并总结归纳了 47条嗅觉基因信息。此外,对草履蚧触角中预测的气味结合蛋白OBPs和化学感受蛋白CSPs序列与蚜虫、盲蝽和扶桑绵粉蚧相关序列构建系统发育树。结果显示,8条气味结合蛋白与蚜虫聚在一起,3条草履蚧气味结合蛋白OBPs聚在一起。2条化学感受蛋白与扶桑绵粉蚧的2条化学感受蛋白分别聚类在一起。根据聚在一起且已知其功能的蚜虫和盲蝽的物种,可以对草履蚧的OBPs功能进行预测。草履蚧嗅觉基因的发现对认识其在蚧虫行为反应中的作用提供新的视角,同时提高蚧虫的生物防治策略。3.本研究在草履蚧雌成虫触角转录组测序和分析的基础上,通过RT-PCR技术得到的气味结合蛋白OBPs(DcorOBP4,5,6,7,8,14)和化学感受蛋白DcorCSP2的编码序列,利用生物信息学的方法对草履蚧这些蛋白的理化性质、信号肽、亲疏水性等进行预测分析。分析表明,这些蛋白均有完整的开放阅读框ORF,N端带有19～29个氨基酸的信号肽,等电点在4.12～9.30之间,相对分子质量为15.6～17.0KDa,这些蛋白均为亲水性蛋白。OBPs(DcorOBP4,5,6,7,8,14)含有六个保守的半胱氨酸位点,符合典型的气味结合蛋白家族的特征。化学感受蛋白DcorCSP2包含有四个保守的半胱氨酸位点,符合化学感受蛋白家族的特征。草履蚧典型的气味结合蛋白(DcorOBP4,5,6,7,8,14)和化学感受蛋白DcorCSP2通过同源建模后发现,三维结构都是由六个α螺旋组成。DcorOBP4,6,7,8这四个气味结合蛋白的六个保守半胱氨酸形成了三对二硫键,与典型的气味结合蛋白特征相符。化学感受蛋白DcorCSP2也构建出两对二硫键,这些二硫键均起到稳定蛋白质结构的作用。以上6条OBPs均由α1,α2,α4,α5,α6这5个α螺旋形成疏水口袋,α3在口袋的一端不参与疏水口袋的形成。此外,这些蛋白的C-末端均折合进入蛋白质的口袋内部,使得口袋结构变得更加稳固。