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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的、严重危害生猪养殖产业的重要疫病之一。临床表现为妊娠母猪流产、死胎和产木乃伊胎,仔猪发病多表现为呼吸障碍。该病于1987年首次在美国爆发,随后在北美洲及欧洲各国流行,引起母猪爆发流产风暴。国内于1996年首次分离到PRRSV毒株命名为CH-1a株,2006年下半年开始,一种以高热(超过41℃)、高发病率(超过50%)和高死亡率(高于20%)为主要特征的“无名高热症”在我国江西省爆发,并迅速蔓延至全国28个省、市和自治区,造成了巨大的经济损失。经鉴定该病的病原为PRRSV变异株-高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)。鉴于该病的严重危害,中华人民共和国农业部于2008年将高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS)列为我国的一类动物疫病。经实践证明将PRRSV野毒在Marc-145细胞系上连续传代的方式是制备PRRSV疫苗的有效手段。2010年以来陆续有3种HP-PRRSV活疫苗通过上述方法研制成功,随着HP-PRRSV弱毒活疫苗在我国的使用,HP-PRRS得到了有效地防控,了解疫苗的分子致弱机理对于PRRS的防控具有指导意义。PRRSV对巨噬细胞具有细胞嗜性,猪肺泡巨噬细胞(PAM)被认为是PRRSV在宿主内复制的主要靶细胞,由于PAM是重要的免疫细胞,具有抗原递呈作用,因此PRRSV野毒感染宿主的PAM被认为是PRRS造成免疫抑制的重要原因。在研究中我们发现将疫苗株HuN4-F112接种PAM后48h,取上清接种下一代PAM,连续感染3次,利用RT-RCR方法从最后一代PAM中检测不到病毒的核酸,这表明HP-PRRSV活疫苗HuN4-F112株在体外对PAM的感染与亲本毒HP-PRRSV HuN4存在显著差异,采用同样的方法对其他3株PRRSV弱毒活疫苗(MLV、CH-1R)检测均得到了对PAM的感染能力显著下降的结果。由于上述疫苗株均是在Marc-145细胞中传代80次以上致弱的,因此我们推断在传代过程中关键基因的突变可能是导致疫苗株对PAM感染能力的降低的重要原因,确定该关键基因对PRRSV致病机理的研究和PRRS的防控具有重大意义。为鉴定影响PRRSVY疫苗株HuN4-F112影响PAM感染效率的关键基因,本研究以2株感染性克隆cHuN4(以亲本株HP-PPRSV HuN4基因组序列构建)和cHuN4-F112(以疫苗株HP-PRRSV HuN4-F112)为骨架,利用分子克隆技术置换相应的基因,构建了10个嵌合的感染性克隆质粒,最终拯救出10株嵌合病毒。采用荧光定量PCR确定病毒原液中病毒密度,分别以Moi=2.0感染4×106 PAM细胞,感染24h分别以抗PPRSV的M蛋白的单克隆抗体和FITC标记的羊抗鼠IgG抗体染色,最后利用流式细胞术评价病毒对PAM的感染效率。通过逐步的截短替换证明,分别以疫苗株和亲本株感染性克隆为骨架分别互换NSP2基因拯救的两株嵌合病毒感染PAM的效率发生显著的改变,其中亲本株HuN4的感染效率显著下降,而疫苗株的感染效率显著上升,这表明NSP2基因是影响了HP-PRRSV疫苗株HuN4-F112在PAM感染效率的关键基因。为鉴定影响NSP2功能的关键氨基酸,以感染性克隆cHuN-F112和RQNSP2 (cHuN-F112为骨架替换cHuN的NSP2基因的嵌合质粒)为骨架利用定点突变技术,分别将NSP2基因上存在差异的氨基酸位点定点突变,构建了10株NSP2突变体。通过PAM感染试验及流式细胞术检测发现,以RQNSP2为骨架将第893位氨基酸由v893突变为A893的病毒和将第979位氨基酸由由S979突变为p979的两株突变体PAM感染效率下降显著,而以cHuN-F112为骨架同时将ORF1a上第893位和979位氨基酸同时突变后,嵌合病毒感染PAM效率显著提高,这表明ORF1a上第893和979位氨基酸为影响NSP2功能的关键氨基酸。为了探索NSP2基因突变影响疫苗株HuN4-F112对PAM感染效率的作用机理,分别将4株互换NSP2或ORF2-7基因的重组病毒及亲本毒HuN4和疫苗株HuN4-F112以Moi=5.0感染PAM细胞。于感染2h、12h、24h、36h和48h分别收集细胞,细胞用PBS反复冲洗离心后去上清提取总RNA,将600 ng RNA反转录成cDNA,最后使用荧光定量PCR检测分析。检测结果显示感染2h检测6株病毒均可侵入PAM细胞且6株病毒拷贝密度不存在明显的差异,在感染后12～24 h 6株病毒基因组RNA均呈现快速复制并且其复制规律相同,这表明疫苗株NSP2的突变并未影响病毒侵入宿主也未影响病毒基因组RNA的合成。感染36～48 h疫苗株HuN4-F112和嵌合HuN4-F112的NSP2基因的HuN4病毒的RNA合成增长缓慢并呈下降趋势,而亲本株HuN4和以cHuN4-F112为骨架替换亲本株NSP2基因的嵌合病毒RNA合成量继续增加；本实验室以前的试验数据表明,PAM分别被HuN4和HuN4-F112感染后,组装病毒粒子的蛋白表达量存在明显差异：通过Western blot检测显示当被HuN4感染24h时,PAM细胞中病毒GP3蛋白的表达量即接近峰值,且24-48h内可持续检测到GP3蛋白的大量表达；但PAM被感染HuN4-F112感染后直至36 h才能检测到微量的GP3蛋白的表达,且直至感染后48 h病毒GP3蛋白的表达量仍是微量的：当两株病毒互换NSP2蛋白后,结果发生了逆转。结合荧光定量PCR和流式细胞术检测的结果推测,在PAM中疫苗株HuN4-F112 NSP2基因的突变导致病毒RNA转录病毒结构蛋白的功能显著降低或推迟,进而影响病毒粒子的组装和释放,最终表现为疫苗感染PAM效率的显著下降。在体外PAM中接种HP-PRRSV疫苗株HuN4-F112几乎检测不到病毒粒子,但疫苗株免疫仔猪后可监测到3-4周的病毒血症,这表明在宿主体内除PAM外疫苗株还存在其他病毒储存或复制的组织。本研究分别以106.0TCID50的疫苗株HuN4-F112感染5头仔猪,并以3×104.0TCID50的HP-PRRSV HuN4株感染3头仔猪作为攻毒对照组,以1头仔猪做为空白对照,感染后1Od、11d、14d和16d分别将其迫杀,采集心、肝、脾、肾等脏器及颌下淋巴结、肺门淋巴结、腹股沟淋巴结和PBMC等淋巴器官和扁桃体、胸腺等免疫器官。将上述组织研磨后取活细胞,采用流式细胞术评价各组织细胞被感染比例。结果显示疫苗免疫组仔猪在感染后10～16d体内仍存在病毒血症,但其外周血淋巴细胞(PBMC)被感染率几乎为零,其PAM感染率较低,主要储存器官为扁桃体,感染率最高可达11.5%,其感染比例有随感染时间推移增高的趋势：此外在各个淋巴结细胞中也检测到了病毒感染；各脏器组织中心脏和脾脏细胞被感染的比例最高,肝细胞和肾细胞感染比例不显著；重要的免疫器官胸腺中未被感染。攻毒对照组中,PAM被感染率比疫苗组高,但最高的感染比例也仅为5.3%,这可能与大部分感染的PAM细胞已经破碎有关。感染率最高的组织为扁桃体,其细胞被感染率分别为14.1%、16.6%和30.7%,此外其淋巴结细胞和脾细胞可被显著感染,被感染比例比疫苗组高,PBMC也几乎未被感染这与疫苗免疫组的结果相同。据此推测疫苗株HuN4-F112由于感染PAM和胸腺细胞效率的下降导致在体内疫苗毒力的降低,但其仍能在扁桃体中复制,从而能刺激机体产生免疫反应,发挥免疫保护作用。本研究确定了影响PRRSV疫苗株HuN4-F112在PAM上复制效率的关键基因,可能部分揭示了该疫苗株致弱的分子机理,对PRRSV的基础研究及下一代疫苗的开发具有重要的意义：此外本研究还确定了PRRSV储存和复制的主要场所扁桃体,对研究PRRSV持续感染机理及临床诊断均具有重要的意义。