【摘 要】
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[背景和目的]肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全球常见的恶性肿瘤,预后差,治疗效果不理想。目前,除了手术、TACE、局部消融疗法、放射介入等方法外,抗CTLA-4、抗PD-1以及抗PD-L1等免疫检查点单抗治疗逐渐成为肿瘤重要的治疗方法,对免疫检查点的探讨成为肿瘤研究的热点。B7-H3（CD276）基因是2001年由Chapoval等在人类树突状细胞（dend
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[背景和目的]肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全球常见的恶性肿瘤,预后差,治疗效果不理想。目前,除了手术、TACE、局部消融疗法、放射介入等方法外,抗CTLA-4、抗PD-1以及抗PD-L1等免疫检查点单抗治疗逐渐成为肿瘤重要的治疗方法,对免疫检查点的探讨成为肿瘤研究的热点。B7-H3（CD276）基因是2001年由Chapoval等在人类树突状细胞（dendritic cell,DC）的c DNA文库中发现,是B7家族重要的免疫检查点成员之一,在多种肿瘤组织中高表达,且与复发风险增高、病理类型差和预后不良有关。基于以上研究背景,本课题组应用RNA干扰技术构建小鼠B7-H3敲低的稳转肝癌细胞株,构建正常免疫系统的小鼠原位肝癌荷瘤模型,从体内外探讨敲低B7-H3的表达对肝癌细胞生长和侵袭的影响,为进一步研究B7-H3对荷瘤小鼠免疫微环境的影响奠定基础,为B7-H3抗体应用于HCC临床治疗提供理论依据。[研究方法]1.Q-PCR检测小鼠肝癌细胞株的表达水平。2.构建shRNA-B7-H3慢病毒载体,感染小鼠肝癌细胞株hepa1-6,建立B7-H3敲低肝癌稳转细胞株（hepa1-6-shB7-H3）;3.通过CCK8细胞增殖实验、Annexin-V凋亡细胞检测和Transwell小室观察B7-H3对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响,在细胞水平探讨B7-H3基因对肝癌细胞生长和侵袭的影响;4.构建带有荧光素的稳定细胞株（Hepa1-6-shB7-H3-luc和Hepa1-6-shNC-luc）,利用这两株细胞构建小鼠B7-H3敲低的小鼠原位肝癌模型,观察动物一般情况、生存期、肿瘤大小以及肿瘤组织形态,探究敲低B7-H3对HCC生长的影响以及炎症细胞浸润情况。[结果]1.两株小鼠肝癌细胞株hepa1-6和H22均有表达B7-H3,hepa1-6的表达水平高于H22细胞。2.成功构建shRNA-B7-H3慢病毒载体;感染Hepa1-6细胞后,进行单克隆细胞株的筛选和培养。通过Western-blot和Q-PCR证实成功获得B7-H3敲低的稳转的肝癌细胞株hepa1-6-shB7-H3。3.敲低B7-H3后进行Hepa1-6的生物学功能检测。与Hepa1-6-shNC组对比,Hepa1-6-shB7-H3细胞的增殖、迁移和侵袭能力降低,差异有统计学意义（P<0.05）;流式细胞术显示Hepa1-6-shB7-H3细胞早期凋亡的百分比明显增加（P<0.05）。4.成功构建C57/BL6小鼠原位肝癌荷瘤模型,通过持续检测发现hepa1-6-shB7-H3-luc组小鼠体内肿瘤体积明显小于对照组（P<0.05）。5.瘤块经HE染色发现Hepa1-6敲低B7-H3后,癌结节数量少,结节周围炎症细胞浸润明显增多。[结论]1.成功构建B7-H3敲低的慢病毒载体,获得带有荧光素酶报告基因的稳定敲低B7-H3的小鼠HCC细胞株。2.通过体外实验发现敲低B7-H3能抑制小鼠肝癌细胞的侵袭、迁移和增殖能力,促进肝癌细胞的早期凋亡。3.成功建立免疫功能正常的小鼠原位肝癌荷瘤模型,敲低B7-H3后肿瘤生长减缓,癌结节少,肿瘤周围炎症细胞浸润增多。
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