水稻抗白叶枯病相关基因的鉴定及功能分析

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水稻SWEET蛋白是一类新型的糖转运蛋白,能够在细胞内以顺浓度梯度的方式促进糖类化合物从细胞膜扩散到质外体中,且不受胞内环境中pH的影响。关于SWEET基因的研究主要集中在模式植物和重要的粮食作物上,比如拟南芥、水稻、大豆、小麦等,但在水稻中对于SWEET蛋白家族成员的系统性研究还不是很多。本研究通过对SWEET基因家族进行相关的染色体定位、基因结构、系统发育树以及基因进化等生物信息学分析,以基因的表达模式分析筛选出能够受白叶枯病菌株诱导的SWEET基因。然后通过CRISPR-Cas 9技术获得OsSWEET基因的突变株,检测突变株在接白叶枯病菌后的抗病情况。以qPCR来检测接菌后OsSWEET基因的表达量并绘制病菌生长曲线,通过转基因技术得到过表达株系来验证相关的SWEET基因在植物抗病反应中的作用。最后阐述OsSWEET蛋白介导植物与病原体间的相互作用。在水稻数据库中筛选出水稻SWEET基因家族成员,主要以基因信息、染色体定位、基因结构、氨基酸比对以及进化树分析手段,从各个层面掌握OsSWEET蛋白成员在结构和功能上的异同性。通过氨基酸比对发现SWEET家族成员都含有保守的MtN3结构域,在结构域中存在多个磷酸化位点作为其功能区域。进化树分析发现OsSWEET15、OsSWEET12与Os8N3、XA25、Os11N3这3个先前已被鉴定过为感病基因编码的蛋白质归为同一类群。通过对家族基因进行核苷酸分析发现这2个基因在水稻驯化历程上并没有太多的有效突变。对这一集群内的基因进行诱导性分析筛选出能受部分白叶枯病菌株诱导表达的OsSWEET12、OsSWEET15基因,中花11在接种PXO86菌株的24h内OsSWEET15的表达量呈周期性增长,且在24h达到最大值。利用CRISPR-Cas 9技术,我们在中花11背景下对OsSWEET12、OsSWEET15基因分别进行定点突变,获得ossweet12、ossweet15突变体。接菌后,发现分离的T1代纯合突变体均表现出抗病表型。相比于野生型12.26±0.94cm,其病斑长度分别降到8.04±0.93cm、7.68±0.42cm。通过qPCR分别对突变体OsSWEET15的表达量以及病菌生长曲线进行分析,发现接种PXO86、PXO79菌株后OsSWEET15的表达量降低,而且突变株的病斑长度和接菌部位的白叶枯病菌群数量要低于野生型。通过PCR技术从中花11中克隆了目标基因并构建OsSWEET15过表达载体转化到高抗籼稻品种镇恢084中,并通过分子手段鉴定已获得转基因苗。目前,转基因植株还在培养中,待后期移栽到实验田里进行接菌实验以及表达情况分析。综上所述,OsSWEET15基因的突变能够影响植物对白叶枯病菌抗性,水稻白叶枯病菌操纵宿主植物的糖转运机制以增加糖的转移,通过影响植物SWEET基因的表达从而达到调控病原体自身的存活与繁殖。OsSWEET15基因作为感病因子在植物抗病反应中发挥着重要的作用。对OsSWEET基因的研究为完善水稻SWEET基因家族功能奠定了基础。
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