研究背景心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)在世界范围内都是威胁人类健康并导致死亡的主要原因。《中国心血管病报告2018》概要显示,无论是城镇居民还是在农村居民,心血管病死亡率都占总死亡原因的首位,远远高于肿瘤及其他疾病。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)已被确定为CVD的主要潜在病因,动脉粥样硬化病变的发生发展可能需要氧化-低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)的参与。动脉粥样硬化及其血栓形成并发症的其他风险因素包括高血压、吸烟和糖尿病等。诱导动脉粥样硬化发生发展的因素很多,巨噬细胞的泡沫化是尤为关键的因素。巨噬细胞在血管壁内聚集是动脉粥样硬化的标志。在动脉粥样硬化病变中,巨噬细胞对各种环境刺激做出反应,如修饰的脂质、细胞因子和衰老的红细胞,可改变其功能表型。了解巨噬细胞的功能及其对动脉粥样硬化斑块形成和生长的作用,将有助于延缓或阻止疾病的发生发展,并为治疗动脉粥样硬化相关疾病及改变其病理生理提供新的理论支持和治疗策略。此外,有研究表明,巨噬细胞分泌的趋化因子对动脉粥样硬化的发生发展也发挥了重要的作用。趋化因子CXCL12,也称为基质细胞衍生因子1(Stromal cell derived factorSDF-1)、趋化因子样功能趋化因子和巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)。CXCL12是广泛表达且高度保守的蛋白,通过与其相应的趋化因子受体CXCR4和ACKR3结合,在细胞稳态、募集和阻滞中发挥重要作用。此外,大量研究证实CXCL12对于造血祖细胞在骨髓中归巢及其向外周动员中起到关键作用。CXCL12/CXCR4除了对祖细胞有这些作用外,还可能通过影响各种动脉粥样硬化相关细胞来影响动脉粥样硬化相关疾病的发生和发展。但巨噬细胞分泌的CXCL12在动脉粥样硬化中起到的作用并不清楚,在本研究中,我们通过一系列的实验设计来探讨巨噬细胞CXCL12在动脉粥样硬化中发挥的作用及其相关机制,解决这一科学问题将为治疗动脉粥样硬化性疾病提供新的理论依据并且有可能创造新的治疗策略。研究目的1.明确巨噬细胞分泌的CXCL12在动脉粥样硬化发生发展中的作用。2.明确巨噬细胞分泌CXCL12是否通过影响血管平滑肌细胞(VSMCs)发挥作用。研究方法1.建立细胞模型利用豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)诱导单核巨噬细胞(THP-1)48小时,使其分化发育成巨噬细胞。然后,使用ox-LDL诱导巨噬细胞转化为泡沫细胞作为动脉粥样硬化的细胞模型。2.细胞免疫荧光检测将VSMCs接种于12孔板的盖玻片上,培养过夜。多聚甲醛固定后,使用Triton X-100透化细胞,然后使用BSA封闭。将细胞与抗α-SMA的一抗在4℃下孵育过夜,然后与Alexa Fluor 488标记的二抗在室温下孵育1小时。DAPI染色显示细胞核。最后,使用激光扫描共聚焦显微镜检测。3.HE、免疫组织荧光(IF)或免疫组织化学(IHC)检测取大鼠或小鼠对照组和模型组肺动脉或胸主动脉做成蜡块,切片后进行相应的染色(HE、IF或IHC)。4.Transwell 共培养将VSMCs接种到Transwell板的下室,将THP-1巨噬细胞接种到上室。然后用ox-LDL处理THP-1巨噬细胞。接下来,将VSMCs和THP-1巨噬细胞共培养24或48小时,用于后续实验。5.细胞增殖检测VSMCs接种于Transwell板的下室,将THP-1巨噬细胞接种于上室。处理结束后,向VSMCs中加入MTT再培养2小时,最后加入DMSO,用酶标仪测定490 nm处的吸光度。6.酶联免疫吸附测定(ELISA)检测孵育48小时后收集细胞培养上清(Transwell共培养体系上室和下室),用CXCL12的ELISA试剂盒进行检测。7.Western blot 检测从THP-1巨噬细胞或VSMCs中提取的总蛋白样品,用10%SDS/PAGE分离。然后,将蛋白条带转移至PVDF膜上,随后用5%脱脂乳封闭。将膜与CXCL12或GAPDH的一抗在4℃孵育过夜。次日,使用1×TBST孵育3次,用HRP标记的羊抗小鼠或抗兔IgG在室温下孵育1小时。用ECL底物检测免疫染色蛋白条带。8.油红O染色将细胞在载玻片上培养过夜,随后用ox-LDL处理,用4%多聚甲醛固定后,用0.3%油红O对细胞染色20分钟,用显微镜观察并采集图像。9.RNA提取及qPCR检测TRIZOL提取细胞总RNA。使用逆转录酶试剂盒将总RNA样品逆转录为cDNA。用SYBR Green qPCR试剂盒进行实时定量PCR测定GAPDH和CXCL12表达的相对水平。10.siRNA细胞转染及shRNA细胞转染将细胞铺板于六孔板中,培养至50-80%。然后根据使用说明书,Lipofectamine 2000转染siRNA,用于后续实验。进行基因shRNA设计,构建载体(由安徽通用生物科技有限公司提供),高纯质粒提取,转染细胞,筛选慢病毒稳转细胞株。11.流式细胞术检测细胞周期弃掉细胞培养上清,用冷PBS冲洗细胞后,轻吹细胞形成细胞悬液,取100ul的细胞悬液于1.5 mL Eppendorf管中,加入PI(最终浓度为50 μg/mL)染料和RNase A(最终浓度为20 μg/mL),避光冰上孵育30min后,用200目滤器过滤细胞,应用流式细胞仪进行细胞周期检测。12.构建动脉粥样硬化动物模型大鼠动脉粥样硬化模型构建雄性Sprague-Dawley大鼠(12周龄)10只,将SD大鼠随机分为对照组(n=5只大鼠)和模型组(n=5只大鼠)。根据参考文献所述,通过向大鼠喂食高脂饲料加维生素D2三周后建立动脉粥样硬化动物模型。小鼠动脉粥样硬化模型构建雌性ApoE-/-小鼠(8周龄)14只,将小鼠随机分为对照组(n=7只小鼠)和模型组(n=7只小鼠)。根据参考文献所述,通过向小鼠喂食高脂饲料24周建立动脉粥样硬化模型。13.统计学分析使用GraphPad Prism 7.0软件分析所有数据,两组之间的数据比较采用独立样本的t检,P值<0.05具有统计学差异。实验结果1.成功构建动脉粥样硬化的细胞模型并进行相应验证ox-LDL诱导巨噬细胞24小时后,油红O染色结果显示,脂质堆积,48小时后,油红O染色结果显示,脂质堆积显著增加,巨噬细胞泡沫化加剧。在ox-LDL处理的巨噬细胞中,CXCL12的表达显著增加,培养上清中巨噬细胞分泌的CXCL12亦显著增加。2.ox-LDL的刺激同样可以促进VSMCs的泡沫化对培养的VSMCs进行α-SMA免疫荧光检测,结果显示所有细胞均为α-SMA阳性。使用油红O染色评价泡沫细胞形成的水平,结果显示ox-LDL处理24后可以诱导脂滴积聚,并在48小时后脂滴积聚显著加剧。通过ELISA和qPCR进一步分别检测了 VSMCs培养上清和VSMCs的CXCL12分泌水平和转录水平,结果发现ox-LDL处理后的VSMCs培养上清CXCL12浓度显著增加,VSMCs的CXCL12转录水平亦显著增加。3.ox-LDL处理的THP-1巨噬细胞促进VSMCs增殖及其泡沫细胞的形成与不用ox-LDL预处理的THP-1巨噬细胞共培养的VSMCs的增殖没有显著提高,相比,与用ox-LDL预处理的THP-1巨噬细胞共培养的VSMCs的增殖显著提高。与上室不放THP-1巨噬细胞,只放ox-LDL的对照组相比,VSMCs的增殖并没有显著提高。此外,结果还发现在经过ox-LDL预处理的THP-1巨噬细胞共培养的VSMCs中,泡沫细胞的形成显著增加。通过ELISA和Western blot检测发现ox-LDL处理后的下室培养基中CXCL12浓度显著升高,上室THP-1巨噬细胞CXCL12的表达也显著提高。4.ox-LDL处理的THP-1巨噬细胞分泌的CXCL12促进VSMCs增殖和泡沫细胞形成在THP-1巨噬细胞中,CXCL12表达能力被siRNA抑制以后,结果发现ox-LDL刺激THP-1巨噬细胞分泌CXCL12的能力显著降低,其促进VSMCs增殖的能力也显著下降。这种条件的基础上,如果加入外源性的CXCL12则能部分逆转siRNA抑制THP-1巨噬细胞带来的影响,VSMCs的细胞增殖能力又得到显著提高。油红O染色检测VSMCs泡沫细胞的形成,与其增殖结果相一致,此外,利用ELISA和Western blot检测下室培养基CXCL12的浓度改变和THP-1巨噬细胞CXCL12表达的改变,其变化趋势与VSMCs增殖是一致的。本课题设计CXCL12的shRNA克隆到pLKO.1载体上,并通过逆转录病毒载体系统,建立稳定干扰CXCL12的THP-1细胞株。通过qPCR和Western blot检测验证构建的细胞系稳定低表达CXCL12,结果证实稳定干扰CXCL12的THP-1细胞系构建成功。在这种体系下,结果发现,VSMCs细胞增殖趋势与siRNA干扰时一致,且能够促进VSMCs细胞进入细胞周期的S期。5.AS大鼠模型中发病大鼠VSMCs增殖且血清中CXCL12的分泌水平显著升高HE染色结果显示,正常对照组未发现明显的动脉粥样硬化病变,但模型组大鼠肺动脉区域的病变明显扩大;免疫组化染色(IHC)结果显示,α-SMA和IBA-1在诱导成功的动脉粥样硬化大鼠模型中都显著增加。CXCL12在动脉粥样硬化大鼠模型血清中的浓度亦显著增加。6.AS小鼠模型中发病小鼠巨噬细胞分泌的CXCL12显著升高且VSMCs增殖显著增加HE染色结果显示,正常对照组未发现明显的动脉粥样硬化病变,但模型组小鼠胸主动脉区域有显著的动脉粥样硬化斑块,在动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞分泌的CXCL12显著升高。同时,模型组VSMCs的增殖与对照组相比显著提高。通过caspase3检测了斑块中巨噬细胞凋亡情况,结果显示斑块中巨噬细胞凋亡亦显著增加。实验结论1.ox-LDL处理THP-1巨噬细胞和VSMCs可以显著提高CXCL12的分泌水平,并能够显著促进其泡沫化。2.ox-LDL处理的THP-1巨噬细胞可以促进VSMCs的增殖。3.ox-LDL处理的THP-1巨噬细胞促进VSMCs的增殖是通过分泌的CXCL12来完成的。4.体内模型中,发现巨噬细胞分泌CXCL12显著提高,VSMCs的增殖亦显著增加。研究背景许多关键信号通路与动脉粥样硬化形成高度相关。这些途径包括:胰岛素受体(和其他受体酪氨酸激酶);Ras和MAPK活化;导致NF-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)活化的TNF-α和相关家族成员;活性氧(ROS)对信号的影响;通过修饰的脂蛋白激活内皮和其他细胞;嘌呤能信号;控制白细胞粘附内皮、迁移和进一步激活;泡沫细胞形成;以及与增殖、胞吐和凋亡相关的巨噬细胞和血管平滑肌细胞信号。它们已成为现代动脉粥样硬化研究的重点,无疑将为未来创新干预和预防现代世界头号死因提供丰富的资源。随着对动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞与血管平滑肌细胞相互作用以及巨噬细胞分泌谱如何影响VSMCs表型的新认识,巨噬细胞来源的泡沫细胞和VSMCs之间的通讯形式也变得越来越清晰。然而,ox-LDL通过激活巨噬细胞什么样的信号通路提高巨噬细胞分泌CXCL12以及CXCL12又是通过怎么样信号通路来促进VSMCs的增殖尚未完明确。因此,探讨上述信号在这个过程中起着怎样的作用有助于更进一步的明确巨噬细胞分泌CXCL12促进动脉粥样硬化的分子机制。在人类动脉粥样硬化病变中初步鉴定出活化的NF-κB后,该转录因子家族参与动脉粥样硬化形成得到了越来越多的关注。现在已经清楚,激活NF-κB的信号通路和NF-κB的作用构成了动脉粥样硬化过程所有阶段的主要参与者。长期以来,人们一直认为NF-κB是一种促动脉粥样硬化因子,最近的研究表明,NF-κB的实际作用可能是更加复杂的。除了激活许多与动脉粥样硬化相关的促炎基因外,NF-κB还调节细胞过程,如细胞存活和增殖。此外,在炎症消退和抗炎基因转录中的重要作用表明,它在动脉粥样硬化过程的不同细胞类型或不同阶段的激活可能有不同或相反的结果。同时,NF-κB信号通路在巨噬细胞向泡沫细胞转化中发挥重要作用。但是否参与巨噬细胞分泌CXCL12不清楚,需要进一步的探讨。细胞内丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号级联在心血管疾病的发病机制中起重要作用。大量的基础科学研究已经明确MAPK通路组织和激活的许多细节,但单个信号蛋白在各种心血管疾病发病机制中的作用仍在阐明中。在本研究中,我们将研究ERK(细胞外信号调节激酶)、JNK(c-Jun氨基末端激酶)和p38信号通路在ox-LDL诱导的动脉粥样硬化模型中巨噬细胞分泌CXCL12促进VSMCs增殖时是否会激活VSMCs的MAPK信号通路发挥作用。该研究有利于探明药物治疗动脉粥样硬化的新靶点。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路是各种受体-酪氨酸激酶诱导的关键信号通路之一。越来越多的证据表明,该通路是细胞生长、代谢、存活、增殖和分化中重要的促进因子,与细胞自噬的调控也密切相关。关于该通路已有大量相关研究,但在动脉粥样硬化中的确切作用仍不清楚。有研究发现,选择性抑制AKT/mTOR信号通路可以通过促进巨噬细胞自噬减少,稳定易损的动脉粥样硬化斑块。亦有研究显示PI3K/AKT信号通路是介导VSMC增殖的重要信号转导通路。因此,有必要深入探讨CXCL12是否通过该信号通路发挥作用。综上,对这些关键科学问题的解决,将为治疗动脉粥样硬化提供新的理论依据和新的治疗靶点。研究目的1.明确ox-LDL诱导THP-1巨噬细胞分泌CXCL12是否通过NF-κB信号通路完成。2.明确ox-LDL诱导THP-1巨噬细胞分泌的CXCL12是否通过激活VSMCs的MAPK信号通路完成。3.明确ox-LDL诱导THP-1巨噬细胞分泌的CXCL12是否通过激活VSMCs的PI3K/AKT/mTOR信号通路完成。研究方法1.人单核细胞细胞系THP-1的培养THP-1细胞用1640培养基(含10%FBS,FBS置55℃灭活30min)于T75细胞培养瓶中,置37℃,5%C02孵箱中常规培养,细胞呈悬浮生长。收集THP-1细胞悬液,用1640培养基(含10%灭活的FBS,佛波酯PMA10ng/mL,PMA用于刺激细胞贴壁)重悬,计数铺于24孔板中继续培养,进行下一步实验。2.BMDM诱导实验无菌取C57小鼠后腿,去掉肉留下骨头,用2ml注射器将骨髓吹出,并用反复吹打数次,将骨髓吹散。Tris-NH4CL红细胞裂解液裂解红细胞。重悬细胞并计数。浓度调整为2×106个细胞/ml。10cm培养皿中可加入7-8ml细胞,用BMDM诱导培养基培养,每2-3天换液,去除悬浮细胞,7天可收获成熟BMDM。3.Transwell 共培养将 VSMCs 接种到 Transwell 板(3422,Coming,NY,U.S.A.)的下室,将 THP-1细胞接种到上室。然后用ox-LDL处理THP-1细胞。接下来,将VSMCs和THP-1细胞培养24或48小时。4.细胞总蛋白的提取及Western Blot实验吸弃各孔细胞培养上清,每孔加入适量含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液,充分裂解细胞,用BCA蛋白浓度检测试剂盒进行蛋白浓度测定。取各孔相应体积的蛋白加入6×蛋白上样缓冲液中,充分混匀,98℃加热5 min,冷却后,可直接将样品用于SDS-PAGE,亦可暂存-20℃或-80℃。根据实验需要取相应体积的蛋白样品及预染蛋白marker上样进行电泳。使用超敏显色液(Thermo scientific,34095)进行ECL法显影。5.SiRNA 转染将细胞铺板于六孔板中,培养至30-50%融合,然后根据生产商的说明,使用 Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA,U.S.A.)转染 siRNA。6.小鼠动脉粥样硬化模型雌性ApoE-/-小鼠(8周龄,购买自北京维通利华,SPF级),将小鼠随机分配至对照组(n=7只小鼠)和模型组(n=7只小鼠)。按照参考文献所述,通过向小鼠喂食高脂饲料24周建立动脉粥样硬化模型。7.统计学分析使用GraphPad Prism7.0软件分析所有数据,两组之间的数据比较采用独立样本的t检,P<0.05具有统计学差异。实验结果1.ox-LDL通过NF-κB信号通路诱导巨噬细胞表达分泌CXCL12无论是THP-1源巨噬细胞还是BMDM在ox-LDL诱导24小时后IκBα(p-IκBα)的磷酸化显著提高;此外,两种巨噬细胞在ox-LDL刺激24小时后磷酸化的p65(p-p65)的表达变化情况跟IκBα是相一致的;然而,两种巨噬细胞在ox-LDL刺激24小时后磷酸化的p52(p-p52)的表达并没有显著变化。NF-κB信号通路被白藜芦醇阻断后,ELISA和Western blot检测培养上清中或THP-1巨噬细胞在ox-LDL诱导下分泌或表达CXCL12的水平显著下降。2.CXCL12通过激活VSMCs的ERK或JNK信号通路而促进VSMCs异常增殖THP1存在的情况下,ox-LDL可以刺激VSMCs的ERK磷酸化显著提高。在此的基础上增加外源CXCL12则会重新使VSMCs的ERK磷酸化水平显著提高。JNK的趋势与ERK一致,但是p38在各组之间没有显著差异。3.PI3K/AKT/mTOR信号通路不参与Transwell体系中CXCL12刺激VSMCs的异常增殖不同条件下VSMCs的AKT的磷酸化水平并没有显著差异,VSMCs的GSK-3β的磷酸化水平没有显著变化,VSMCs的mTORC1的磷酸化水平亦没有显著变化。4.白藜芦醇显著减轻ApoE-/-小鼠高脂饮食诱导动脉粥样硬化的斑块面积,高脂饮食的ApoE-/-小鼠如果同时给予白藜芦醇饮水,则显著降低其动脉粥样硬化斑块面积。实验结论1.ox-LDL通过激活THP-1或BMDM的NF-κB信号通路的经典途径中p65的磷酸化而促进CXCL12的表达和分泌。2.参与CXCL12刺激VSMCs增殖的可能效应分子是MAPK信号通路下游的ERK或JNK,而不是p38。3.PI3K信号通路中的AKT、Raptor或者GSK-3在CXCL12刺激VSMCs增殖中不发挥作用。