目的脑神经胶质瘤是一种常见的中枢神经系统的恶性肿瘤，发病率居所有神经系统肿瘤首位，约占35%~60%。随着医学技术的不断发展，以手术治疗为主，结合术后放疗、化疗的个体化综合治疗已成为胶质瘤治疗的主要手段，但临床上相当一部分患者对常规化疗的敏感性较差，以往认为是因血脑屏障影响化疗药物到达肿瘤细胞。近年来研究证实，脑神经胶质瘤化疗效果受诸多方面原因的影响，其中化疗药物的耐药性是导致化疗失败的重要原因之一。因此，如何提高胶质瘤患者对化疗药物的敏感性，寻找更有效的治疗靶点逐渐成为胶质瘤术后辅助治疗的重点课题。胶质瘤分子遗传学研究发现，几乎所有类型的胶质瘤均伴有不同程度的癌基因的激活以及抑癌基因的下调甚至缺失，而学者研究认为上述基因的突变不仅参与肿瘤发生发展，还与肿瘤耐药性密切相关。近年来，越来越多的基因治疗进入临床试验阶段，而脑神经胶质瘤基因靶向治疗为脑胶质瘤的治疗提供了新的思路。程序性细胞死亡-5（PDCD5）是一种新发现的促凋亡因子，与基因缺失突变体的构建及其相关功能密切相关，且可能参与促凋亡活性的功能结构域的编码过程。同时学者发现PDCD5在影响肿瘤组织的表达中也具有重要作用。现已有试验证实，PDCD5在胃癌、卵巢癌、肾透明癌等多种肿瘤疾病中的表达水平明显下降，且与肿瘤预后有密切联系，但其在脑神经胶质瘤中的表达水平，对神经胶质瘤发生、发展的影响，能否影响胶质瘤的化疗敏感性并作为胶质瘤靶基因治疗的可行性，目前尚缺乏有力证据。为了明确抑癌基因PDCD5在脑神经胶质瘤中的表达及其对化疗药物的敏感性，将PDCD5发展成为相对安全、有效的基因治疗靶点提供实验依据，本文主要进行了以下两方面的研究。1.抑癌基因PDCD5在脑神经胶质瘤中的表达及其作用。2.抑癌基因PDCD5表达对胶质瘤细胞生长及化疗敏感性的影响。方法一、抑癌基因PDCD5在脑神经胶质瘤中的表达及其作用1.收集吉林大学第一临床医院医院神经外科2009年1月-2012年12月收治的神经胶质瘤患者石蜡包埋组织共86例，同时收集2013年1月-2014年12月在吉林大学第一临床医院神经外科接受手术治疗的脑神经胶质瘤患者的新鲜标本30例，癌旁组织标本1例。2.分别利用RT-PCR、Western Blot及免疫组化方法检测神经胶质瘤细胞系U87、U251及原发性神经胶质瘤组织中PDCD5mRNA及蛋白质的表达情况。3.比较分析脑神经胶质瘤患者PDCD5的表达与胶质瘤临床病理生理学特点的相关性，利用Kaplan-Meier生存曲线分析PDCD5的低表达或缺失与预后之间的关系。二、抑癌基因PDCD5表达对胶质瘤细胞生长及化疗敏感性的影响1.采用不同浓度的化疗药物替莫唑胺（TMZ）处理胶质瘤细胞系U87及U251，应用MTT法绘制细胞生长曲线，分析PDCD5的表达水平对胶质瘤细胞系生长率的影响，及与不同浓度TMZ化疗敏感性的关系。2.利用基因转染技术将PDCD5重组表达载体转染胶质瘤细胞系U87，应用RT-PCR及Western Blot及免疫组化的方法检测转染后PDCD5的表达，筛选稳定克隆的U87-PDCD5细胞，并利用MTT法比较U87-PDCD5和未转染的U87的细胞生存率，分析外源性PDCD5过表达对脑神经胶质瘤化疗敏感性的影响。3.根据目的基因PDCD5设计合成PDCD5特异性siRNA靶点，并将siRNA转染高表达PDCD5的胶质瘤细胞系U251及稳定转染的U87-PDCD5，采用RT-PCR及WesternBlot的方法评价干扰效果，分析siRNA沉默后PDCD5的表达对胶质瘤细胞系化疗敏感性的影响。4.建立脑胶质瘤细胞系U87裸鼠皮下荷瘤模型，将模型随机分为4组，分别注射生理盐水（对照组，n=5），TMZ（TMZ组，n=5），外源性PDCD5重组表达载体（PDCD5组，n=5），TMZ+外源性PDCD5重组表达载体（联合组，n=5）。治疗20d后断颈处死所有裸鼠，切取肿瘤组织并测量组织体积、称重。采用RT-PCR、Western Blot方法检测体内PDCD5的表达，分析PDCD5联合TMZ对脑神经胶质瘤生长的影响。结果一、抑癌基因PDCD5在脑神经胶质瘤中的表达及其作用1. PDCD5mRNA在脑神经胶质瘤细胞系、原发性胶质瘤中的表达RT-PCR结果显示，PDCD5mRNA在U87、U251均有不同程度的表达，且PDCD5mRNA在U87中的相对表达量明显低于在U251中的相对表达量，差异有统计学意义（P<0.05）。与癌旁组织比较，PDCD5mRNA在原发性脑神经胶质瘤中的表达出现不同程度的下调，甚至缺失，差异有统计学意义（P<0.05）。2. PDCD5蛋白在脑神经胶质瘤细胞系、原发性胶质瘤中的表达Western Blot结果显示，PDCD5蛋白在U87中的表达较弱，明显低于在U251中的表达。癌旁组织PDCD5蛋白的表达水平较高，而原发性脑神经胶质瘤PDCD5蛋白的表达水平则不同程度的下调，甚至缺失。免疫组化结果显示，在癌旁组织中，PDCD5阳性表达主要位于胶质细胞核及细胞浆内，呈棕黄色颗粒，其分布表现为明显的异质性，而在脑神经胶质瘤组织中，PDCD5染色较弱，甚至呈阴性表达。3. PDCD5在脑神经胶质瘤的表达状态和脑神经胶质瘤的病理分期相关性RT-PCR结果显示，PDCD5mRNA相对表达量在高级别脑神经胶质瘤中的表达明显低于低级别，差异有统计学意义（P<0.05）。免疫组化结果显示，脑神经胶质瘤中组织中PDCD5蛋白的表达随病理分级增高而减低，差异均有统计学意义（P<0.05），而与年龄、性别、组织分型无关（P>0.05）。4. PDCD5在脑神经胶质瘤中的低表达或缺失与预后的相关性Kaplan-Meier生存分析结果显示，所有患者平均生存时间19.6个月（95%CI:17.3~21.8），其中低表达组平均生存时间17.5个月（95%CI:15.1~19.9），高表达组平均生存时间23.7个月（95%CI:19.5~27.8），经log-rank检验，低表达组的生存时间显著短于高表达组，差异有统计学意义（χ2=4.94，P<0.05）。二、抑癌基因PDCD5表达对胶质瘤细胞生长及化疗敏感性的影响1. PDCD5表达与胶质瘤细胞生长及化疗敏感性的关系MTT法结果显示，当TMZ浓度在0~110μmol/L范围时，细胞生存率与TMZ浓度呈剂量依赖性，随着TMZ浓度的升高，U87和U251细胞的相对生存率均随之下降，且U251细胞生存率下降的更为明显，说明U251对TMZ的敏感性高于U87。当TMZ浓度大于110μmol/L时，生存率变化不大。2.外源性PDCD5过表达对神经胶质瘤细胞化疗敏感性的影响RT-PCR结果显示，U87-PDCD5细胞中PDCD5mRNA的表达明显高于未转染U87，且PDCD5mRNA在U87-PDCD5中的相对表达量明显高于在未转染U87中的相对表达量，差异有统计学意义（P<0.05）。Western Blot结果显示，U87-PDCD5的蛋白质水平明显高于未转染U87中PDCD5。MTT法结果显示，当TMZ浓度在0~110μmol/L范围时，细胞生存率与TMZ浓度呈剂量依赖性，随着TMZ浓度的升高，U87和U87-PDCD5细胞的相对生存率均随之下降，且U87-PDCD5细胞生存率下降的更为明显，说明其对TMZ的敏感性高于U87。当TMZ浓度大于110μmol/L时，生存率变化不大。3. siRNA沉默PDCD5表达对神经胶质瘤细胞生长及化疗敏感性的影响RT-PCR结果显示，转染PDCD5siRNA后，与对照组比较，U251、U87-PDCD5胶质瘤细胞内PDCD5mRNA的表达均明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）。Western Blot结果显示，转染PDCD5siRNA后，U251、U87-PDCD5胶质瘤细胞内PDCD5蛋白的表达明显下降，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。转染后采用MTT法检测细胞的生长率，结果显示，随着TMZ浓度的升高，U87-PDCD5-siRNA和U251-siRNA细胞的相对生存率均随之下降，而U87-PDCD5-siRNA、U251-siRNA均明显高于对照组，即对TMZ的化疗敏感性降低。4. PDCD5联合TMZ对脑神经胶质瘤生长的影响联合组肿瘤体积、体重分别为（1.78±0.07mm3、0.21±0.03g）均明显低于对照组（3.46±0.06mm3、0.58±0.04g）、TMZ组（2.73±0.13mm3、0.37±0.06g）、PDCD5组（2.34±0.11mm3、0.34±0.05g），差异均有统计学意义（P<0.05）。经两两比较，各组肿瘤体积、体重依次为对照组> TMZ组、PDCD5组>联合组，其中TMZ组、PDCD5组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。RT-PCR、Western Blot方法检测结果显示，含PDCD5载体的联合组和PDCD5组PDCD5mRNA及蛋白的表达高于对照组和TMZ组，表明PDCD5在荷瘤模型体内成功表达。结论1. PDCD5mRNA和蛋白在脑神经胶质瘤患者中表达明显下调甚至缺失，且PDCD5的表达随病理分级增高而减低，而与年龄、性别、组织分型无关，PDCD5低表达或缺失的脑神经胶质瘤患者的生存时间显著短于高表达者。2. PDCD5过表达可明显抑制胶质瘤细胞的生长，增强脑神经胶质瘤对化疗药物TMZ的化疗敏感性，沉默表达PDCD5后脑神经胶质瘤对TMZ的敏感性明显降低；PDCD5与TMZ联合应用可更好地抑制脑神经胶质瘤的生长，有望成为一种新的临床治疗靶点。