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香菇多糖(Lentinan, LNT)具有广泛的生物学活性,包括免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗病毒,等等。其中LNT的免疫调节作用是其生物活性的重要基础。研究表明,LNT是典型的T细胞激活剂,通过在体内诱导巨噬细胞产生多种生物活性因子,促进T细胞的增殖活化,增强Th和Tc细胞的功能,导致一系列免疫应答的发生。目前,LNT已在抗肿瘤、抗炎等临床治疗中被广泛应用,而且也被研制开发为各种天然保健品。但是由于多糖难以被机体降解吸收,关于口服多糖发挥功效的机制尚不明确,具体这类大分子物质是如何进入机体发挥作用的,学界也存在各种不同的看法。近年来,对肠道粘膜免疫的研究日益受到重视并逐渐深入,肠道粘膜免疫系统(Intestinal Mucosal Immune System, IMIS)能选择性地对饮食中的抗原物质产生耐受,对病原微生物抗原产生免疫应答,并能通过淋巴细胞的归巢和再循环影响机体整体免疫。IMIS也是口服LNT最先接触的场所,既往研究表明,LNT能显著改善免疫抑制小鼠肠道粘膜免疫功能障碍,包括增强T细胞对外界抗原的敏感性,恢复淋巴细胞亚群的正常比例,并且对小鼠整体免疫紊乱和抑制状态均有相应改善。综上所述,本课题将以香菇多糖(LNT)为代表,研究其对肠道粘膜免疫系统T细胞亚群的影响,为研究中药多糖发挥免疫药理作用的靶点奠定基础。研究目的：建立并优化淋巴细胞内细胞因子流式细胞术检测的实验条件,在迟发型超敏反应(DTH)小鼠模型基础上,比较LNT对不同部位各T细胞亚群的影响；以及采用环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠模型,初步探讨LNT对不同部位αβT细胞和γδ T细胞的影响,从上述两方面探讨LNT对粘膜免疫的潜在作用。研究方法：1.细胞内细胞因子检测的条件优化利用流式细胞术建立小鼠淋巴细胞内细胞因子检测的方法,以CD3/CD69作为评价指标,对实验条件进行优化,包括刺激剂浓度的选择和蛋白质转运阻断剂的比较选择。通过对比不同浓度(25、50、75ng/ml)佛波酯(PMA)与离子霉素(Ionomycin)共刺激淋巴细胞5h后的细胞因子分泌量,确定PMA的最优浓度;通过比较两种蛋白质转运阻断剂(BFA/Monensin Mixture和Monensin)对T细胞膜表面和胞内CD69阳性表达率的影响,选择适合的蛋白质转运阻断剂。2.DTH小鼠模型的复制及LNT对DTH小鼠不同部位T细胞亚群比例变化的影响以二硝基氟苯(DNFB)诱导复制迟发型超敏反应(DTH)小鼠模型,观察小肠派氏结(PPs)、肠系膜淋巴结(MLN)、脾脏(SP)和耳后淋巴结(RLN)中T细胞表面活化分子CD69表达的情况、CD4+/CD8+T细胞、以及Th1/Th2和Tcl/Tc2细胞亚群的变化；灌服LNT(800mg/kg)10天后,观察LNT对DTH小鼠耳肿胀度及上述不同部位T细胞亚群的影响。3.LNT对免疫抑制模型小鼠不同部位T细胞的影响灌服LNT800mg/kg,7天,采用环磷酰胺免疫功能抑制小鼠模型,利用流式细胞术,观察LNT对SP、PPs和MLN中αβ和γδ T细胞亚群的影响。结果：1.75ng/ml PMA与lonomycin共刺激淋巴细胞5h后的IFN-y和IL-4的表达量明显高于其他两个浓度；阻断剂BFA/Monensin Mixture (BM)对T细胞膜表面CD69表达的阻断明显强于Monensin (MN),BM组CD69表达率与为刺激对照相当；且BM组的胞内CD69表达也高于MN组,以上均表明阻断剂BM能更有效阻断胞内蛋白向膜外表达。2.以DNFB诱导的DTH小鼠,各部位T细胞活化早期标志CD69的表达显著性升高;SP与RLN中CD4/CD8比值显著下降,PPs中CD4/CD8比值显著上升：而MLN各指标无显著性差异：DTH小鼠四个部位Th与Tc细胞亚群呈不完全同步的变化趋势,主要以Tcl (CD8+IFN-γ+)显著升高为特征。3.灌服香菇多糖10天后,能减轻DTH小鼠的耳肿胀度：SP与PP中CD4/CD8比值显著下降,MLN中CD4/CD8比值显著上升,而RLN各指标无显著性差异;四个部位Th与Tc细胞亚群的变化,主要以SP中IL-4的降低、局部以RLN和MLN中IFN-γ和IL-4升高为主要特征。4.腹腔注射环磷酰胺(CY)100mg/kg,24h后观察到CY能使各部位αβ T细胞比例升高,灌服香菇多糖后,PPs和MLN中αβ较CY组显著升高,而PPs中γδ T细胞比例恢复至与正常组相当。结论：1.通过胞内因子检测的条件优化,确定75ng/ml PMA+1μg/ml lonomycin共刺激淋巴细胞5h,并选择BFA/Monensin Mixture为有效的蛋白质转运阻断剂。2.不管是DTH模型还是免疫抑制模型,均属于免疫功能紊乱的实验模型。在上述模型下,LNT对各部位T细胞亚群的作用虽然存在差异性,但对PPs和MLN的作用更明显,而且对免疫功能的紊乱具有调节和恢复的作用,并推测香菇多糖可能与T细胞在各部位中的重新分配有关,并对粘膜免疫系统一定的选择性。