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阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)的主要神经病理学特征之一是大量形成以过度磷酸化的微管相关蛋白tau为主要成分的神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）。AD患者脑中异常过度磷酸化的tau的聚积是导致神经元功能受损的重要原因，但其机制尚不清楚。体外研究发现从AD患者脑中提取的由过度磷酸化的tau形成的双螺旋丝结构(PHF)中，tau蛋白不仅被磷酸化，还被泛素化，而后者是被蛋白酶小体系统降解的重要信号;进一步研究发现，AD患者脑中蛋白酶小体的活性是下降的，且PHF在体外可以直接抑制蛋白酶小体的活性，但两者之间的关系及其在AD病变过程中的作用尚不清楚。为了研究在体内蛋白酶小体系统对tau的磷酸化及其生物学功能的影响以及tau的磷酸化对蛋白酶小体活性的作用，我们将人最长tau异构体(tau441)稳定转染到HEK293细胞内，用不同浓度的蛋白酶小体20S的不可逆性抑制剂Lactacystin作用于细胞，研究蛋白酶小体活性下降对tau蛋白磷酸化及tau微管结合功能的影响;用不同浓度的蛋白磷酸酯酶(PP)-2A的抑制剂岗田酸(OA)处理细胞，诱导tau的过度磷酸化，研究tau的磷酸化对蛋白酶小体活性的影响;在用Lactacystin预处理细胞后，研究OA诱导的tau磷酸化及tau微管结合功能的变化以及与蛋白酶小体活性的关系。主要结果如下: 一、蛋白酶小体对tau蛋白的降解特性及其生物学功能的影响 蛋白酶小体活性被抑制后，免疫印迹结果显示磷酸化的tau与非磷酸化的tau的含量都呈浓度依赖性增加，且磷酸化的tau与非磷酸化的tau的比率各组之间呈浓度依赖性升高，提示磷酸化的和非磷酸化的tau都是蛋白酶小体的降解底物，且磷酸化的tau较非磷酸化的tau更易被蛋白酶小体系统降解。在蛋白酶小体活性被抑制时，用紫杉酚(Taxol)稳定微管后将微管从细胞中分离，用免疫印迹法检测沉淀中的tau蛋白（与微管结合部分的tau）和上清部分的tau蛋白(可溶性的tau)的量，并与同部位的管蛋白(tubulin)显色比较，判断tau蛋白微管结合能力的改变。结果发现tau与微管的结合能力下降，且与tau的磷酸化程度呈负相关性，说明蛋白酶小体活性下降，将直接损伤tau的微管结合功能，这一过程与蛋白酶小体活性下降导致的tau的过度磷酸化有关。同时发现抑制蛋白酶小体时，磷酸酯酶PP2A的催化亚单位的表达下降，说明蛋白酶小体系统可能作用于参与tau磷酸化调节的蛋白磷酸酯酶，并对tau的磷酸化进行调节。 二、tau蛋白的磷酸化水平对蛋白酶小体活性的影响 为了检测tau蛋白的磷酸化水平对蛋白酶小体活性的影响，我们用OA诱导tau的磷酸化，用荧光底物Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-AMC检测蛋白酶小体胰蛋白酶样的活性，结果显示较低程度的tau磷酸化可激活蛋白酶小体，而当tau的磷酸化升高到一定程度时，则可明显抑制其活性。由于发现了低浓度的tau的磷酸化激活了蛋白酶小体的现象，我们用40nMOA、5μM Lactacystin及Lactacystin和OA同时处理细胞，结果发现，与对照组相比，40nMOA处理细胞，蛋白酶小体的活性升高至对照组的125.3％，5μM Lactacystin处理细胞，蛋白酶小体的活性降低至对照组的28％，但当用Lactacystin预处理细胞后再加入OA，蛋白酶小体活性为对照组的46.9％，介于单独OA和Lactacystin处理之间。我们进一步用Forskolin诱导tau的磷酸化证明了tau的磷酸化对蛋白酶小体活性的影响与其磷酸化程度相关。该结果提示蛋白酶小体功能的抑制在AD的病变过程中可能是一个较晚的过程，可继发于tau的异常过度磷酸化。 三、抑制蛋白酶小体对OA诱导的tau过度磷酸化的影响 免疫印迹结果显示:Lactacystin预处理后再加入OA时，与单纯OA处理组相比，tau蛋白在Tau-1表位(Ser198/Ser199/Ser202)显色增强，PHF-1(Ser396/Ser404)和PS262(Ser262)表位的显色减弱。提示在蛋白酶小体活性被抑制时，OA诱导的细胞的tau的磷酸化减弱，其原因可能与蛋白酶小体抑制时，细胞内其他蛋白降解途径被代偿性激活，从而加强了对OA诱导的磷酸化的tau蛋白的降解作用，故此时磷酸化的tau较单纯OA处理组减弱。 四、抑制蛋白酶小体活性对OA处理细胞中tau的微管结合功能的影响 Lactacystin预处理后再加入OA处理细胞，tau的微管结合能力较单纯OA或单纯Lactacystin处理组明显下降，而此时tau蛋白在Ser198/Ser199/Ser202、Ser396/Ser404和Ser262位点的磷酸化程度虽较正常组升高，却低于单纯OA或Lactacystin处理组，提示除tau的磷酸化外，可能还有其他因素参与了tau的微管结合功能的调节。 结论: tau蛋白是蛋白酶小体的降解底物之一，且磷酸化的tau较非磷酸化的tau更易被该系统降解;抑制蛋白酶小体活性，可以引起磷酸化的tau的量异常增加，其原因可能与磷酸化的tau经蛋白酶小体途径降解减少和/或蛋白磷酸酯酶(PP2A)活性失调有关;抑制蛋白酶小体活性使tau的微管结合能力下降，这种功能损害与tau的磷酸化有关，但单纯磷酸化不能完全解释这种功能的损害;tau蛋白的磷酸化对蛋白酶小体的活性影响与tau的磷酸化程度相关，低程度的tau的磷酸化可以激活蛋白酶小体，而高水平的tau的磷酸化可以抑制蛋白酶小体的活性。总之，抑制蛋白酶小体活性可以导致tau的聚积，尤其是磷酸化的tau，tau的磷酸化对蛋白酶小体活性的影响与其磷酸化程度具有相关性，蛋白酶小体活性下降可能是AD的晚期事件。抑制蛋白酶小体的活性可以加重OA诱导的tau的微管结合功能的损伤。